银杏内生菌Endo Gin Ya6合成胞外多糖培养条件的优化

王 　 爽，　王 　 璐，　许 春 雨，　马 志 扬，　李 　 晗，　叶 淑 红

( 大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连　116034 )



银杏内生菌EndoGin Ya6合成胞外多糖培养条件的优化

王 爽，王 璐，许 春 雨，马 志 扬，李 晗，叶 淑 红

( 大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连116034 )

摘要:银杏内生菌Endo Gin Ya6能产生与银杏多糖具有相似功能性的胞外多糖。试验优化了银杏内生菌Endo Gin Ya6合成胞外多糖的培养条件，测定菌株胞外多糖含量，并以多糖产量为指标，采用单因素与正交试验相结合的方法，最终确定出该菌株合成胞外多糖最佳培养基组成为：蔗糖12%，酵母浸粉0.8%，氯化钠0.5%，磷酸氢二钾0.1%，氯化钾0.1%，培养基初始pH 7.5。最佳发酵条件为：装液量70 mL，发酵温度为28 ℃，摇床转速为200 r/min，接种量为2%，培养时间36 h。在此条件下，菌株产胞外多糖能力可达10.265 g/L。

关键词:银杏；植物内生菌；胞外多糖

0引言

银杏(GinkgobilobaL.)是我国特有的药食同源植物[1]，其中银杏多糖是银杏叶提取物中重要的活性成分[2-3]。近年来的研究表明，银杏多糖具有清除自由基、增强机体抗氧化、延缓机体衰老进程的作用；能促进荷瘤小鼠及环磷酰胺损伤小鼠脾淋巴细IL-2胞活性，抑制血清sIL-2R的形成，从而提高小鼠的免疫功能；并有抑制人急性早幼粒白血病HL-60细胞增殖作用等功能[4-6]。另外，由于银杏多糖独特的功能性和安全性及其可改善食品的食用品质、加工品质等特性，可作为抗氧化剂、稳定剂以及乳化剂等应用于食品的生产加工中[7]。

基于某些内生菌能产生和其共生植物相同或相似生物活性物质的特点[8-10]，可从植物中筛选出可产生生物活性物质的内生菌，并通过发酵得到大量的产物[11-13]。从银杏健康组织中筛选出的细菌可产生与银杏叶多糖结构和功能相似的胞外多糖，通过深层发酵可实现工业化[14]，从而避免从植物中提取多糖造成的资源枯竭，使生产不再受到地域及季节的限制[15]。目前，国内外对银杏内生菌的研究大都集中在抗菌活性或可以产生黄酮类物质的内生菌，对产生类银杏多糖内生菌还鲜有研究。本试验通过优化银杏内生菌EndoGin Ya6合成胞外多糖的发酵条件，提高该菌株产胞外多糖产量，以期为类银杏叶多糖的研究开发提供一定的理论基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株

银杏内生菌EndoGin Ya6：由本试验室从银杏芽中分离、鉴定并保藏。

1.1.2发酵培养基

葡萄糖5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，磷酸氢二钾1 g，水1 000 mL，pH 7.3～7.5[16]。

1.2方法

1.2.1葡萄糖标准曲线的制作

配制0.2 mg/mL的葡萄糖标准液，用苯酚硫酸法于490 nm下测定吸光度，横坐标为葡萄糖标准液的质量浓度，纵坐标为吸光度，绘制葡萄糖标准液曲线[16]。

1.2.2胞外多糖含量测定

取10 mL发酵液在4 000 r/min的条件下离心10 min，取上清液加3倍体积95%乙醇，4 ℃下醇沉过夜，离心取沉淀，加适量水复溶后[17]，用苯酚硫酸法测定多糖含量[18]。

1.2.3发酵产糖培养基的优化

分别以乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖为碳源(3%)，确定最佳碳源；改变培养基中碳源的添加量，确定碳源添加量；将培养基的氮源分别改为0.3%酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、硝酸钠、氯化铵、尿素，以确定最佳氮源；培养基中氮源的添加量分别为0.2%～1.0%，确定氮源添加量；钠、钾、铁、锰、钙、镁等是常见的生长因子，因此在添加0.5%氯化钠的基础上，培养基中分别加入0.1%的磷酸氢二钾、硫酸铁、氯化锰、氯化钾、氯化钙、氯化镁，确定培养基中无机盐添加的种类；用氢氧化钠调节培养基初始pH，确定培养基最佳pH。基础发酵条件为接种量2%、28 ℃、180 r/min、36 h。

1.2.4发酵产糖条件的优化

使用优化的发酵培养基，分别改变装液量、温度、摇床转速以及接种量，考察各发酵条件对菌株胞外多糖产量影响。

1.2.5正交试验优化

根据单因素试验结果采用L9(34)正交试验，如表1所示以蔗糖质量分数(A)、酵母浸粉质量分数(B)以及pH(C)和装液量(A)、温度(B)、摇床转速(C)及接种量(D)作为考察因素(表2)，选取3个水平进行试验，确定最佳培养基组成及发酵条件。

表1　培养基优化正交试验因素和水平

表2　发酵条件优化正交试验因素和水平

2结果与讨论

2.1发酵培养基条件的优化

2.1.1碳源的选择

由图1可知，以蔗糖作为碳源菌株的产糖能力最高，同时蔗糖还能为菌株生长提供多种氨基酸和所需维生素，为菌株提供了适宜的生长环境，故选择蔗糖作为碳源。

图1　不同碳源对胞外多糖产量的影响

2.1.2碳源用量

以蔗糖为碳源，考察不同质量分数的蔗糖对发酵过程中胞外多糖产量的作用，如图2所示。随着蔗糖质量分数的增大，多糖的产量也随之增加，当质量分数超过12%，多糖的产量反而下降。这可能是由于碳源的含量较小而无法满足微生物的生长需要，而当碳源的浓度过高时，也会对微生物的生长有抑制作用。

2.1.3氮源的选择

考察不同氮源对菌株胞外多糖产量的影响。

图2　蔗糖质量分数对Endo Gin Ya6菌株胞

如图3所示，以酵母浸粉作为氮源时，菌株产糖量最高，可达到6.88 g/L，以尿素作为氮源时菌株的产糖量最低。这说明与无机氮源相比，有机氮源更有利于菌株的产糖发酵。因此，选择酵母浸粉作为该菌株产糖发酵的氮源。

图3　不同氮源对菌株胞外多糖产量的影响

2.1.4氮源用量

考察不同质量分数的酵母浸粉对菌株胞外多糖的产量的影响。由图4可知，当培养基中氮源的质量分数为0.8%时，菌株的产糖量最高，因此选择氮源的添加量为0.8%。

图4　酵母浸粉质量分数对菌株胞外多糖产量的

2.1.5无机盐

由图5可知，在添加氯化钠的基础上，在培养基中添加氯化钾和磷酸二氢钾时对多糖产量有促进作用，且磷酸氢二钾具有缓冲液的性质，可为菌株提供稳定的代谢环境，因此，选择氯化钾和磷酸二氢钾两种无机盐作为除氯化钠以外的无机盐的辅助，以丰富培养基的营养。

图5　无机盐种类对菌株胞外多糖产量的影响

2.1.6初始pH

培养基的初始pH对菌株胞外多糖产量也有较大影响。由图6可知，当pH为8.5时，菌株的产糖量最高，可达9.55 g/L。

图6　初始pH对菌株胞外多糖产量的影响

2.1.7培养基组成的正交试验结果

对培养基组成进行正交试验，结果如表3所示，3个因素对菌株胞外多糖含量影响的主次顺序为C,A,B，最佳组合为A2B2C1，即蔗糖12%，酵母浸粉0.8%，培养基初始pH 7.5，在此条件下进行验证试验，菌株胞外多糖产量可达9.233 g/L。

表3　培养基组成正交试验数据分析表

2.2发酵产糖条件的优化

2.2.1装液量

在250 mL锥形瓶中装入不同体积的培养基，考察不同的装液量对多糖产量的影响。从图7可知，当装液量达到70 mL时，菌株的产糖量最高。

图7　装液量对菌株胞外多糖产量的影响

2.2.2温度

在发酵时，温度对微生物的生长有密切的影响，且对微生物代谢产物的合成有重要作用。由图8可以看到，在28 ℃时菌株胞外多糖产量最高，这可能是因为该温度最适合菌株生长，其胞外多糖产量也达到最高。

图8　温度对菌株胞外多糖产量的影响

2.2.3摇床转速

在发酵过程中，摇床转速越高，溶氧量越多，越适合菌株的生长。如图9所示，在一定范围内，多糖的产量同转速呈正相关。达到一定转速时，多糖产量增速变慢，从经济的角度考虑，选择摇床的转速为180 r/min。

2.2.4接种量

如图10所示，当接种量低于3%时，菌体数量较少，相同时间内通过发酵得到的多糖含量也较低；当接种量超过3%时，菌体数量过多，菌体间存在着竞争，影响了胞外多糖的合成与积累。

图9　摇床转速对菌株产胞外多糖产量的影响

图10　接种量对菌株胞外多糖产量的影响

2.2.5发酵条件优化的正交试验结果

对菌株产胞外多糖发酵条件进行优化，正交试验结果如表4所示，4个因素对试验结果影响的主次顺序为A，C，B，D，最佳组合为A2B2C3D1，即装液量为70 mL，28 ℃，摇床转速200 r/min，接种量2%，在此最佳条件下进行验证试验，菌株胞外多糖产量可达到10.265 g/L。

表4　发酵条件优化正交试验数据分析表

3结论

菌株EndoGin Ya6产胞外多糖最佳培养基组成：蔗糖12%，酵母浸粉0.8%，氯化钠0.5%，磷酸氢二钾0.1%，氯化钾0.1%，培养基初始pH 7.5。最佳发酵条件为：装液量70 mL，28 ℃，摇床转速200 r/min，接种量2%，培养时间36 h，在此条件下进行验证试验，菌株产胞外多糖能力可达10.265 g/L。

本试验表明，不同培养基组成和发酵条件对银杏内生菌EndoGin Ya6产胞外多糖的能力有不同影响。对EndoGin Ya6合成胞外多糖的培养条件进行优化，菌株胞外多糖的产量可达10.265 g/L，与戴余军等[19]和陈义勇等[20]直接从银杏叶中提取银杏叶多糖相比，发酵多糖具有优势，为银杏多糖的进一步研究和应用奠定了基础。

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Optimization of fermentation conditions of extracellular polysaccharides fromEndoGin Ya6

WANGShuang,WANGLu,XUChunyu,MAZhiyang,LIHan,YEShuhong

( School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:Extracellular polysaccharides from Endo Gin Ya6 was similar to that from Ginkgo biloba L. in functional properties. In this paper, the yield of extracellular polysaccharides was estimated and the culture condition of extracellular polysaccharides from Endo Gin Ya6 was optimized by orthogonal experiment. The optimal culture condition for extracellular polysaccharides production were: sucrose 12%, yeast extract 0.8%, NaCl 0.5%, K2HPO40.1%, KCl 0.1% at pH 7.5 and 200 r/min, 28 ℃ for 36 h. The highest yield of extracellular polysaccharides of Endo Gin Ya6 was 10.265 g/L

Key words:ginkgo; endophyte; extracellular polysaccharide

作者简介:王 爽(1990-)，女，硕士研究生；通信作者：叶淑红(1972-)，女，教授.

基金项目:国家自然科学基金资助项目(31370554).

收稿日期:2014-12-31.

中图分类号:TS201.3

文献标志码:A

文章编号:1674-1404(2016)01-0001-05