寡糖特异性麦芽糖酶产生菌的产酶条件优化

刘 赛 男, 顾 艳 丽, 张 慧, 李 宪 臻

(大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034)

0 引 言

麦芽糖是重要的淀粉糖品种,在人体代谢中不需胰岛素就能被吸收[1]。纯麦芽糖可用于糖尿病患者静脉输液,是糖尿病患者的营养剂和辅助治疗剂,所以高纯度的麦芽糖在医药上具有重要的价值[2]。目前的麦芽糖生产是将淀粉通过真菌淀粉酶和β-淀粉酶处理[3],产生由葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、四糖等麦芽低聚糖以及多糖组成的普通麦芽糖浆[4]。要得到高麦芽糖浆,还要再添加脱支酶和β-淀粉酶共同作用,或用葡萄糖淀粉酶等对普通麦芽糖浆进行后处理[5]。由于后处理所添加的酶都能水解麦芽糖,造成原料的浪费,并且难以获得高产率的纯麦芽糖[6-9]。

寡糖特异性麦芽糖酶可以作用于麦芽三糖、四糖等麦芽糖低聚糖生成葡萄糖和麦芽糖,从而提高麦芽糖的含量和纯度[10]。本研究以分离到的一株能够降解麦芽低聚糖的寡糖特异性麦芽糖酶产生菌M136为对象,并以实验室自制麦芽低聚糖作为酶解底物对菌种的产酶条件进行了优化。

1 材料与方法

1.1 微生物菌株

寡糖特异性麦芽糖酶生产菌M136,本实验室分离保存。

1.2 培养基

固体培养基：普通麦芽糖浆20 g/L,酵母浸粉1.0 g/L,琼脂20 g/L。

基础培养基：普通麦芽糖浆/麦芽低聚糖浆(实验室自制)20 g/L,酵母浸粉1.0 g/L。

1.3 酶活力分析方法

以自制麦芽低聚糖(500 g/L)作为酶解底物,将0.96 mL粗酶液与40 μL麦芽低聚糖混合后,在37 ℃水浴中反应1 h,用DNS法测定还原糖。

酶活力单位定义：每小时催化麦芽低聚糖降解生成1 mg还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。

1.4 产酶条件优化

分别调整菌体生长时间、温度、基础培养基初始pH、碳源的种类和质量浓度以及氮源的种类和质量浓度,在转速为150 r/min的摇床培养24 h。9 000 r/min离心后取上清液为粗酶液,测定酶活力并比较以确定最佳产酶条件。

2 结果与讨论

2.1 培养基初始pH对产酶的影响

将基础培养基的初始pH分别调至4.0～10.0进行发酵培养24 h,观察pH对产酶的影响,结果见图1。pH在6.0～7.5产酶相对较高,在pH为6.5时产酶最高。可以在较广的pH范围内保持一定的产酶量。

图1 培养基初始pH对产酶的影响

2.2 碳源种类对产酶的影响

分别在培养基中加入葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽低聚糖、糊精、可溶性淀粉和纤维糊精等碳源,考察碳源对产酶的影响,结果如图2所示。作为碳源,单糖和二糖不如低聚糖和多糖效果好,而由不含单糖和多糖的麦芽低聚糖作为碳源更能提高产酶,可能存在一定诱导作用。

2.3 碳源浓度对产酶的影响

以麦芽低聚糖作为碳源,调整碳源的质量浓度依次为10、20、30、40、50和60 g/L,对菌种进行发酵培养24 h,观察不同碳源浓度对产酶的影响。结果如图3所示。随着碳源浓度升高,酶产量也升高,50 g/L时达到最高,碳源的质量浓度高于50 g/L,对产酶具有一定的抑制作用。

图2 碳源对产酶的影响

Fig.2 Effect of carbon source on production of maltogenase

图3 碳源的质量浓度对产酶的影响

Fig.3 Effect of concentration of carbon source on production of maltogenase

2.4 氮源种类对产酶的影响

以麦芽低聚糖作为碳源,分别加入蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉膏、硝酸铵和尿素等氮源,观察不同氮源对产酶的影响,结果如图4所示。无机氮源不利于产酶,有机氮源较适合产酶,其中酵母浸粉为最佳氮源。

图4 氮源对产酶的影响

Fig.4 Effect of nitrogen source on production of maltogenase

2.5 氮源浓度对产酶的影响

以酵母浸粉作为氮源,调整氮源的质量浓度依次为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 g/L,对菌种进行发酵培养24 h,观察氮源质量浓度对产酶的影响,结果如图5所示。随着氮源浓度升高,酶产量也升高,2.0 g/L时达到最高,碳源的质量浓度高于2.0 g/L时,对产酶具有一定的抑制作用。

图5 氮源的质量浓度对产酶的影响

Fig.5 Effect of concentration of nitrogen source on production of maltogenase

2.6 温度对产酶的影响

选择20、28、37、45和50 ℃作为培养温度,观察菌体在不同温度下培养24 h的产酶情况,结果见图6。在37 ℃时,寡糖特异性麦芽糖酶的产量最高,温度过高和过低对产酶都有影响。

图6 温度对产酶的影响

Fig.6 Effect of temperature on production of maltogenase

3 结 论

实验结果表明,M136菌能够生产寡糖特异性麦芽糖酶,该酶具有将麦芽低聚糖降解并生成葡萄糖和麦芽糖的能力,该菌株可以在较广的pH范围内保持一定的产酶量。以单糖和二糖作碳源不如低聚糖和多糖的效果好,而由不含单糖和多糖的麦芽低聚糖作为碳源更能提高产酶,存在一定诱导作用。随着碳源浓度升高,酶产量也升高,而过高的碳源浓度对产酶反而具有一定的抑制作用。无机氮源不利于产酶,有机氮源较适合产酶。随着氮源浓度升高,酶产量也升高,碳源浓度过高对产酶具有一定的抑制作用。在37 ℃时,寡糖特异性麦芽糖酶的产量最高,温度过高和过低对产酶都有影响。综上所述,该菌株最佳产酶条件为：以麦芽低聚糖作为碳源,碳源的质量浓度为50 g/L,以酵母浸粉作为氮源,氮源的质量浓度为2 g/L,发酵时间为24 h,温度为37 ℃,培养基初始pH为6.5。

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