无性型虫草菌株qsun-1的生长特性

张 晓 君, 孙 庆 元, 王 建 军

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

虫草菌[Cordycepssinensis(Berkey) Sacc.]隶属于真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、子囊菌纲(Ascomycetes)、粪壳菌亚纲(Sordariomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草属(Cordyceps)[1-3]。一般虫草菌侵染寄主后,菌丝体分化形成垫状结构即子座。子座膨大并产生子实体,即子囊壳,成熟的子囊壳中产生子囊和子囊孢子。在野外虫草菌孢子在夏季萌发侵染土壤中的蝙蝠蛾幼虫后,形成的子座在次年5月份长出地面[4],貌似草,这种蝙蝠蛾幼虫与虫草菌的复合体称为冬虫夏草。冬虫夏草主要分布于我国的青藏高原海拔3 500～5 000 m的高山草甸或高山灌丛草甸,在四川、云南和甘肃也有少量分布[5]。作者从野外采集的冬虫夏草中分离无性型虫草菌株,对菌虫体组织和子座组织萌发、无性型虫草菌株菌落形态及显微结构进行了观察,同时对无性型虫草菌株发酵培养基组成成分进行了优化,以期为人工培育冬虫夏草以及无性型虫草菌株发酵提供理论基础。

1 实验材料

1.1 冬虫夏草

新鲜冬虫夏草,采自四川省阿坝藏族羌族自治州黑水县,冰箱中4 ℃保存。

1.2 培养基

分离培养基(PDA培养基):马铃薯20%,葡萄糖2%,VB10.01%,KH2PO40.1%,MgSO40.1%,琼脂2%,pH 6.0。用于无性型虫草菌株的分离。

斜面培养基(1%牛肉粉PDA培养基):马铃薯20%,葡萄糖2%,牛肉粉1%,VB10.01%,KH2PO40.1%,MgSO40.1%,琼脂2%,pH 6.0。用于无性型虫草菌株的保藏。

基础培养基:葡萄糖3%,牛肉粉2%,KH2PO40.1%,MgSO40.1%,VB10.01%,pH 6.0。用于无性型虫草菌株的发酵。

2 实验方法

2.1 分 离

用水清洗冬虫夏草表面的杂质,在无菌条件下分别用0.1%氯化汞、75%酒精对冬虫夏草进行表面消毒,无菌水冲洗多次[6],以头部为界将其剪开,生长子座的头部称为子座组织,头部以外的称为菌虫体组织。将子座及菌虫体组织分别放入分离培养基中,在18 ℃培养,观察,重复3次,统计萌发情况,并且挑取萌发的菌丝体进一步分离纯化后接入斜面培养基保藏。

2.2 生长观察

将分离的无性型虫草菌株qsun-1分别接入PDA及1%牛肉粉PDA平板中,18 ℃培养,观察生长情况。同时将接有无性型虫草菌株qsun-1的PDA培养基放在15、18、25、32 ℃培养,观察生长情况。以菌落直径作为衡量生长情况的指标,每隔5 d测量1次。

2.3 显微结构观察

无菌操作,用接种棒从液体培养基中挑取菌丝,放在滴有纯化水的载玻片上,轻轻将菌丝展开,不染色直接用显微镜进行观察[7]。

2.4 发酵培养基的优化

将无性型虫草菌株qsun-1在1%牛肉粉PDA液体培养基中活化3 d,以5%的接种量接入发酵培养基。发酵条件:装液量每250 mL装100 mL,温度18 ℃,摇床转速120 r/min,时间5 d。发酵结束后3 000 r/min离心10 min分离菌丝体,烘干称重。

以葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉及甘露醇为碳源,确定最佳碳源。确定蔗糖为最佳碳源后,分别考察1%、2%、3%、4%、5%蔗糖对无性型虫草菌株qsun-1菌体生长的影响,确定最佳蔗糖质量分数。以牛肉粉、蛋白胨、NaNO3、(NH4)2SO4及尿素为氮源,确定最佳氮源。确定蛋白胨为最佳氮源后,分别考察0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%蛋白胨对无性型虫草菌株qsun-1菌体生长的影响,确定最佳蛋白胨质量分数。上述条件确定后依次考察0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25% MgSO4和KH2PO4对无性型虫草菌株qsun-1菌体生长的影响,确定最佳的MgSO4、KH2PO4的质量分数[8-10]。

3 结果与分析

3.1 萌发和分离

对新鲜冬虫夏草不同部位进行分离,得到无性型虫草菌株qsun-1(表1)。由表1可以看出,冬虫夏草子座组织的菌体萌发率为60%,而菌虫体组织的菌体萌发率仅达到14%,可见子座组织菌丝体容易萌发,而菌虫体组织可能由于易受杂菌污染而使萌发受阻。因此,作者从冬虫夏草子座中培养并分离了无性型虫草菌株。

3.2 生长特点

3.2.1 菌落形态

无性型虫草菌株qsun-1在PDA和1%牛肉粉PDA平板中生长10 d后菌落形态有所不同(图1)。在PDA培养基中菌落稍微隆起,中心凹陷并有少量水珠,灰白色,菌丝较短,菌落周围有一透明圈[图1(a)],菌落背面暗黄色[图1(b)],菌落直径21 mm。在1%牛肉粉PDA培养基中菌落明显隆起,纯白色,菌丝粗壮[图1(c)],菌落背面淡黄色[图1(d)],菌落直径30 mm。

图1 菌株qsun-1菌落形态

3.2.2 菌落生长情况

无性型虫草菌株属于嗜低温菌株,对温度变化反应显著。在不同温度下培养的无性型菌株qsun-1生长状况也不同(表2)。无性型虫草菌株qsun-1在15～18 ℃生长良好,在25 ℃生长受到抑制, 在32 ℃条件下未发现菌株生长。

表2 不同温度下菌株qsun-1菌落直径

3.3 显微结构

对无性型虫草菌株qsun-1液体培养物进行显微观察,从显微结构可以看到液体培养的菌丝主要为管状菌丝,菌丝有较明显的分隔,粗细均匀,每节菌丝均透明(图2)。

图2 菌株qsun-1显微结构(×250)

3.4 发酵培养基的优化

3.4.1 碳源对qsun-1生长的影响

无性型虫草菌株qsun-1可以利用多种碳源。当蔗糖为碳源时生长最好,菌体产量达到8.0 g/L,其次是果糖、甘露醇、淀粉和葡萄糖(表3)。

3.4.2 蔗糖质量分数对qsun-1生长的影响

无性型虫草菌株qsun-1在蔗糖为1%时生长较慢；在蔗糖质量分数达到2%时,生长量最大； 当蔗糖质量分数超过2%时,菌体生长受到一定程度的抑制；当蔗糖质量分数达到5%时,菌体生长明显受阻(图3)。

图3 蔗糖质量分数对菌株qsun-1生长的影响

3.4.3 氮源对qsun-1生长的影响

无性型虫草菌株qsun-1可利用多种氮源。当以蛋白胨为氮源时生长最好,菌体产量达到8.1 g/L,其次为NaNO3、牛肉粉、(NH4)2SO4。以尿素为氮源时,未见无性型虫草菌株qsun-1生长(表4)。

3.4.4 蛋白胨质量分数对qsun-1生长的影响

无性型虫草菌株qsun-1在蛋白胨为0.5%时,生长缓慢;随着蛋白胨质量分数的增加生长量逐渐增加,在蛋白胨质量分数达到2%时,菌体生长达到最大值;蛋白胨质量分数超过2%后,菌体生长受到抑制(图4)。

图4 蛋白胨质量分数对菌株qsun-1生长的影响

3.4.5 MgSO4质量分数对qsun-1生长的影响

无性型虫草菌株qsun-1在MgSO4为0.05%时生长较慢,在MgSO4达到0.1%时生长量达最大;MgSO4超过0.1%后生长受到一定程度的抑制,并随着MgSO4浓度的增加而抑制程度增加(图5)。

图5 MgSO4质量分数对菌株qsun-1生长的影响

3.4.6 KH2PO4质量分数对qsun-1生长的影响

无性型虫草菌株qsun-1在KH2PO4为0.05%时生长较慢,随着KH2PO4浓度的增加生长量逐渐增加,在0.2%左右时达到最大值,在超过0.2%后菌体生长受到抑制(图6)。

图6 KH2PO4质量分数对菌株qsun-1生长的影响

4 结 论

冬虫夏草子座组织菌丝体容易萌发,而菌虫体组织中可能由于易受杂菌污染菌丝体萌发受阻。作者从冬虫夏草子座中培养并分离出无性型虫草菌株qsun-1。通过在PDA和1%牛肉粉PDA中培养无性型虫草菌株qsun-1,发现1%牛肉粉PDA更适于qsun-1生长,qsun-1在1%牛肉粉PDA培养10 d,菌落明显隆起,纯白色,菌丝粗壮,菌落背面淡黄色,菌落直径30 mm。观察qsun-1的显微结构,可以看到液体培养的菌丝主要为管状菌丝,菌丝有较明显的分隔,粗细均匀,每节菌丝均透明。通过在不同温度下培养菌株qsun-1,发现其生长温度范围在15～18 ℃。无性型虫草菌株qsun-1最佳发酵培养基组成为:蔗糖2%,蛋白胨2%,MgSO40.1%,KH2PO40.2%。

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