海洋细菌B1109产胞外多糖的培养条件

张 熹，祖 国 仁，陈 莉，刘 阳

（大连工业大学 生物与食品工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引言

生物活性多糖因其具有调节人体生理功能与增强免疫力的作用，而成为当前国内外科学研究的热点课题［1-3］。海洋微生物所处的高盐、高压、低温、寡营养的特殊环境使其遗传及生理特性与陆地微生物有所不同，赋予其独特的生化结构和生存机制，是开发新型多糖类免疫调节剂的重要资源［4］。海洋微生物胞外多糖是海洋微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的多糖或多糖复合物，以适应其生存环境，维持生命活动。这类多糖大多是由多种单糖按照一定比例组成的杂多糖，其中葡萄糖、半乳糖和甘露糖最为常见；另外还含有葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基糖和丙酮酸等［5］。海洋微生物胞外多糖具有抗肿瘤、增强免疫、清除自由基和抗氧化等活性［6］。本文主要对1株海洋细菌产胞外多糖的发酵条件进行初步的研究。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 种

海洋细菌B1109，从大连金石滩凉水湾海区潮间带海泥中分离得到。

1.1.2 培养基

发酵培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏1 g/L，蒸馏水400 mL/L，陈海水600mL/L。

种子培养基：同发酵培养基。

试管斜面培养基：发酵培养基加入琼脂20g/L。

1.1.3 仪 器

ZHWY-2102C空气恒温振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；YXQ-SG46-280SA 手提式高压消毒器，上海市医疗仪器厂；TGL-16G 高速离心机，上海安亭科学仪器厂；722 型分光光度计，上海分析仪器厂；ZPS-250智能生化培养箱，黑龙江东拓仪器制造有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 测定方法

生物量测定：取定量的菌体培养液，稀释一定的倍数后，用722分光光度计在600nm 下测定OD 值，以空白培养基作为对照。

多糖的测定：取定量发酵液于3 000r/min离心20 min，取上清液，加3 倍95%乙醇沉降，4 ℃冰箱内保存。再次离心后将沉淀溶于水，加1倍氯仿正丁醇混合溶液离心去蛋白，取上清液，加3倍95%乙醇，冰箱沉降。将沉淀溶于一定量的水，苯酚-硫酸法测定胞外多糖［7］。

1.2.2 培养条件

海洋细菌B1109菌株活化。取1～2环海洋细菌B1109接入种子培养基，28 ℃，200r/min摇床震荡培养24h。将其取一定量接入装有发酵培养基的100mL的三角瓶中，28 ℃摇床振荡培养一定时间，按方法“1.2.1”测定碳源、氮源及不同培养条件对海洋细菌B1109 产胞外多糖的影响，并以培养基装量、温度、接种量和培养基初始pH 培养条件为实验因素，设计3 个水平，进行L9（34）正交试验，综合考察培养条件对产胞外多糖的影响，见表1。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 The table of orthogonal experiment factor horizontal

2 结果与讨论

2.1 碳源对海洋细菌B1109产胞外多糖的影响

选取培养基装量300 mL/L 三角瓶，种子接入量2%（相对培养基装量），培养温度28 ℃，培养基初始pH 自然。改变发酵培养基中的碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、牛肉膏和甘露醇），按实验方法“1.2.2”进行实验，测定胞外多糖，结果见图1。

图1 碳源对海洋细菌B1109产胞外多糖的影响Fig.1 Effect of carbon sources on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

碳源是菌株生长过程中为菌株提高碳素来源的物质，菌株的生长及多糖的积累均受碳源的种类和加入量的影响。菌株利用碳源是具有选择性的，糖类一般是良好的碳源和能源物质，但菌株对不同糖类物质的利用也有差别。从图1可见，以麦芽糖、葡萄糖甚至蔗糖作为碳源，海洋细菌B1109产胞外多糖都相对较高，考虑工业葡萄糖来源广泛且价格便宜，本研究以葡萄糖作为产糖的碳源。

2.2 氮源对海洋细菌B1109产胞外多糖的影响

按上述同样培养条件，以葡萄糖为碳源，改变发酵培养基中的氮源（蛋白胨、玉米浆、干酪素、硫酸铵、氯化铵和硝酸钠），按实验方法“1.2.2”进行实验，测定胞外多糖，结果见图2。

图2 氮源对海洋细菌B1109产胞外多糖的影响Fig.2 Effect of nitrogen sources on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

氮源是菌株生长另一个重要元素，氮源的有无，菌株利用的好坏直接影响菌株的生长，从而影响菌株对多糖的积累。从图2可见，以硫酸铵为氮源，海洋细菌B1109产胞外多糖效果最好。

2.3 碳、氮质量浓度对海洋细菌B1109 产胞外多糖的影响

按上述同样培养条件，以葡萄糖、硫酸铵为碳源和氮源，选取发酵培养基中碳源的质量浓度分别为10、20、30、40、50 和60g/L，按实验方法“1.2.2”进行实验，测定胞外多糖，再以确定的最佳碳源质量浓度，选取氮源质量浓度分别为2、3、4、5、6和7g/L进行实验，结果见图3、4。

图3 碳源质量浓度对海洋细菌B1109产胞外多糖的影响Fig.3 Effect of carbon content on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

图4 氮源质量浓度对海洋细菌B1109 产胞外多糖的影响Fig.4 Effect of nitrogen content on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

碳、氮是微生物菌株生长不可缺少的2种元素，同时二者在培养基中的质量浓度也直接影响着菌株的生长与代谢产物的合成。质量浓度过低则不能满足菌株生长的需要，质量浓度过高也会抑制菌株的生长。只有在较适合浓度时，才能促进菌株的生长，并产生代谢产物。从图3 和图4可见，葡萄糖质量浓度为20g/L，硫酸铵质量浓度为4g/L时，海洋细菌B1109产胞外多糖效果最好。

2.4 培养条件对海洋细菌B1109产胞外多糖的影响

2.4.1 培养基初始pH 对海洋细菌B1109产胞外多糖的影响

选取发酵培养基碳源、氮源为葡萄糖和硫酸铵，质量浓度分别为20和4g/L，培养条件同上，调整发酵培养基的初始pH 为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，按实验方法“1.2.2”进行实验，测定胞外多糖，结果如图5所示。

图5 培养基初始pH 对海洋细菌B1109产胞外多糖的影响Fig.5 Effect of culture medium initial pH on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

不同微生物菌株其生长及代谢产物积累的pH 要求是不同的，从图5可见，海洋细菌B1109产胞外多糖较佳pH 7.0～8.0，中性偏碱性，以培养基初始pH 8.0为最佳。

2.4.2 培养基装量对海洋细菌B1109产胞外多糖的影响

培养条件同上，确定培养基初始pH 为8.0，分别在100 mL 三角瓶中装入20、30、40、50、60和70mL 的发酵培养基，按实验方法“1.2.2”进行实验，测定胞外多糖，结果如图6所示。

图6 培养基装量对海洋细菌B1109产胞外多糖的影响Fig.6 Effect of culture medium volume on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

在确定的摇床转数下，培养基装量多少实际反映的是微生物菌株对氧的需求。从图6可见，在100 mL 的三角瓶中，培养基装量为30～40mL，海洋细菌B1109产糖较高，以装量40mL时产糖最高。

2.4.3 接种量对海洋细菌B1109产胞外多糖的影响

按上述同样培养条件，确定培养基装量40mL，选取种子接入量分别为2%、4%、6%、8%、10%和12%，按实验方法“1.2.2”进行实验，测定胞外多糖，结果如图7所示。

图7 接种量对海洋细菌B1109产胞外多糖的影响Fig.7 Effect of inoculation quantity on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

在定量基质培养基中，种子接入量过少，在一定时间菌株生长达不到一定数量；种子接入量过多，菌体浓度过密，也影响其生长，最终结果都会影响胞外多糖的产生。从图7可见，6%的种子接入量，海洋细菌B1109产胞外多糖效果较好。

2.4.4 培养温度对海洋细菌B1109产胞外多糖的影响

按上述同样培养培养条件，确定种子接入量6%，分别在22、24、26、28、30和32℃条件下培养海洋细菌产胞外多糖，测其产糖量，结果见图8。

图8 温度对海洋细菌B1109产胞外多糖的影响Fig.8 Effect of temperature on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

不同的微生物菌株有不同的适合生长温度，一般海洋微生物更适合较低的温度，从图8可见，随着温度升高，海洋细菌B1109 产糖量逐渐增大，26 ℃产糖达到高峰，28 ℃以上开始下降。

2.4.5 培养条件的正交试验

以培养条件单因素试验为基础，以培养基装量、温度、接种量和培养基初始pH 培养条件为试验因素，设计3个水平，进行L9（34）正交试验，结果见表2。

表2 正交试验因素水平结果Tab.2 The result of orthogonal experiment factor horizontal

从表2的R值大小可知，各因素影响主次顺序为：B＞C＞A＞D，即培养温度＞接种量＞培养基装量＞培养基初始pH；产胞外多糖最优水平组合为：A2B1C2D2，即培养温度24 ℃，接种量6%，培养基装量400mL/L，培养基初始pH 8.0。从实验结果可见，在确定的营养成分碳源、氮源条件下，影响海洋细菌B1109产胞外多糖的首要因素是培养温度。海洋微生物长期生长在一个较低的温度环境，其生长和产生胞外多糖对温度的要求较高，这符合海洋微生物的特性；其次是接种量，培养基装量和培养基初始pH 影响不大。

2.5 海洋细菌B1109产胞外多糖动力曲线

以上述确定的最佳培养条件培养海洋细菌B1109，选取培养时间为24、48、72、96、120、144和168h，测定产胞外多糖和生长情况，结果见图9。

图9 海洋细菌B1109生长和产胞外多糖Fig.9 Growth and producing exopolysaccharides of marine bacterium B1109

由图9可见，海洋细菌B1109从24h后就开始进入快速生长期，96h达到生长高峰，之后进入稳定期。胞外多糖的产生的高峰时间是在120h，即在菌株生长进入稳定期之后，最高产糖为4.29g/L。

3 结论

海洋细菌B1109产胞外多糖最适碳源、氮源分别为葡萄糖和硫酸铵。质量浓度分别为20和4g/L。其培养基组成为：葡萄糖20g/L，硫酸铵4g/L，酵母膏1g/L，蒸馏水400 mL/L，陈海水600mL/L，pH 8.0。

海洋细菌B1109 产胞外多糖培养条件为：100mL三角瓶装量40 mL，接种量6%，24 ℃，200r/min

摇床培养120h。在此条件下，胞外多糖产量4.29g/L。

海洋细菌B1109培养24～96h为快速生长期，96h以后进入稳定期。产胞外多糖高峰时期在稳定期120h。