丹参药渣中丹参酮IIA的分离纯化

石 岭，洪 皓，张 雁，刘 廷 强，鱼 红 闪，金 凤 燮

（大连工业大学 生物与食品工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引言

丹参（SalviamiltiorrhizaBge.）是唇形科鼠尾草属的多年生草本植物，中药丹参是植物丹参的干燥根及根茎［1］。

丹参中的主要有效成分为脂溶性丹参酮类和水溶性丹酚酸类［2］。脂溶性丹参酮类主要包括丹参酮ⅡA、丹参酮I、隐丹参酮、次甲丹参醌等；水溶性丹酚酸类主要以丹酚酸B 为主，还包括丹酚酸A、C、D、E、F、G、原儿茶醛、原儿茶酸等［3-4］。丹参酮ⅡA 是丹参中脂溶性活性成分的代表物质，常作为评价丹参药材质量的重要指标。丹参酮ⅡA 药理活性主要有天然抗氧化作用、心血管药理作用、抗感染作用、抗肿瘤作用、对神经细胞保护作用、性激素样活性，对肝、肾、肺的保护作用，增强机体免疫功能、镇痛、抗衰老等作用［5］。

我国丹参中成药制备通常采用丹参和三七混合水浸，其水溶性浸出物和其他药物混合制成丹参中成药。但是水浸丹参和三七的药渣中还含有丹参脂溶性成分——丹参酮等，为了充分利用丹参药渣中的脂溶性成分——丹参酮，本文主要研究了从水浸丹参后药渣中分离纯化丹参酮ⅡA，为其工业化提供依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

丹参酮ⅡA、次甲丹参醌、隐丹参酮标准品，大连工业大学朱靖博教授提供，纯度在95%以上；硅胶，青岛海洋化工厂生产；薄层层析板Silica Gel 60-F254，德国Merck公司生产。

1.2 方 法

1.2.1 丹参药渣中丹参酮的提取

丹参和三七水浸后的湿药渣经干燥、乙醇提取、浓缩干燥得到丹参药渣乙醇提取物；丹参药渣乙醇提取物，用7倍体积的乙醚提取3次，每次浸泡2d，合并提取液、减压浓缩、干燥，得到丹参酮复合物。

1.2.2 硅胶柱层析分离

样品胶的制备：称取乙醚提取的丹参酮复合物加入适量80～100目的硅胶，放入瓷碗中并倒入乙酸乙酯，搅拌使固体充分溶解，置于50 ℃水浴锅上加热，待溶剂挥发后即成样品胶。

装硅胶柱：在底部塞有脱脂棉的硅胶柱里装入300～400目的硅胶作为分离胶，保持上表面水平，抽真空使之细密均匀，在其上加入一层4cm高的80～100目的硅胶，起到缓冲作用，然后再装入干燥好的样品胶并在其表面铺上脱脂棉层。

梯度洗脱：柱装好后，首先用纯石油醚通柱，柱子打通后，以V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=99∶1～90∶10为流动相进行梯度洗脱。此过程由薄层层析检测监控，调整洗脱液中石油醚与乙酸乙酯的比例，每瓶收集150mL，根据薄层层析检测结果收集洗脱液。

1.2.3 分析方法

分析样品的制备：称取丹参酮标准品1 mg，溶于1mL的色谱甲醇中；样品丹参酮1mg，溶于1mL的色谱甲醇中。

薄层层析法：在薄层层析板上，用毛细管吸取标准品及样品，点样于薄层层析板上，每次点样依照样品浓度确定点样次数，每次点样均须用电吹风吹干。丹参酮展开剂：V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）∶V（冰醋酸）=8∶3∶1，直接观察。

高效液相色谱法：高效液相色谱仪，美国Waters 2695-2996DAD；色谱柱，Hypersil ODS2（5μm，150mm×4.6mm）；进样量，10μL；体积流量，1.0 mL/min。流动相A 为水，B 为甲醇。流动相比例如表1所示。

表1 HPLC检测的流动相条件Tab.1 Condition of mobile phase for HPLC

2 结果与讨论

2.1 丹参药渣中丹参酮的提取

称取丹参药渣乙醇提取物500g，用7倍体积的乙醚提取3次，每次浸泡2d，合并提取液、减压浓缩、干燥，得到丹参酮复合物146g，得率为29.2%。

为检测丹参药渣乙醇提取物中丹参酮提取情况及丹参酮是否提取完全，取少量乙醚提取3次后的残渣，用乙醚溶解，进行TLC检测，如图2所示。

图2 丹参药渣中丹参酮的提取Fig.2 Extraction of tanshinone in the dregs

由图2可看出，乙醚提取的丹参酮复合物，以V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）∶V（冰醋酸）=8∶3∶1 作为展开剂，丹参酮展开距离较好，作为TLC法检测丹参酮的展开剂较为理想；丹参药渣乙醇提取物经乙醚提取3次，丹参酮基本提取完全。从图2也可看出，乙醚提取的丹参酮复合物中丹参酮ⅡA 含量较高，适合丹参酮ⅡA 的分离纯化。

2.2 丹参酮ⅡA 分离纯化

丹参酮ⅡA 的分离纯化，用硅胶柱层析法进行，称取12g乙醚提取的丹参酮复合物加入80～100目的硅胶30g，放入瓷碗中并倒入乙酸乙酯，搅拌使固体充分溶解，置于50 ℃水浴锅上加热，待溶剂挥发后即成样品胶。然后在底部塞有脱脂棉的硅胶柱里装入300～400目的硅胶200g作为分离胶，保持上表面水平，抽真空使之细密均匀，在其上加入一层4cm 高的80～100目的硅胶作为缓冲层，再装入干燥好的样品胶并其表面铺上脱脂棉层。纯石油醚通柱，柱子打通后，以V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=99∶1～90∶10为流动相进行梯度洗脱，每瓶收集150mL，对收集液进行TLC检测，部分TLC检测结果，如图3所示。

图3 硅胶柱分离丹参酮复合物的TLC 部分检测图Fig.3 Tanshinone separated by silica gel column on TLC

根据图3薄层层析检测结果可知，1～20瓶丹参酮ⅡA 没有被洗出，21～26瓶主要含有丹参酮ⅡA，在27 瓶已含有次甲丹参醌，丹参酮ⅡA的分离比较成功，表明硅胶柱可用于丹参酮ⅡA的分离纯化；对21～26瓶收集液进行低压浓缩、结晶、抽滤、干燥，首次得到丹参酮ⅡA 晶体0.08g，得率为0.67%，再次结晶得到0.03g不纯的丹参酮ⅡA。

2.3 丹参酮ⅡA 结晶纯度检测

上述丹参酮ⅡA 结晶纯度采用高效液相色谱法检测。称取1mg首次结晶得到的丹参酮ⅡA，溶于1 mL 色谱甲醇，进样10 μL，体积流量1.0mL/min，检测波长270nm。检测结果，如图4所示，丹参酮ⅡA 的出峰时间为24.329min，检测出丹参酮ⅡA 纯度为96%。

图4 高效液相色谱法检测丹参酮ⅡA 纯度Fig.4 Examination tanshinoneⅡA on HPLC

3 结论

丹参药渣乙醇提取物利用乙醚溶液提取3次，丹参酮基本提取完全，丹参酮复合物从丹参药渣乙醇提取物的得率为29.2%。应用硅胶柱层析法制备丹参酮ⅡA，用V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=99∶1～90∶10进行梯度洗脱，纯品丹参酮ⅡA 得率为0.67%，纯度达到96%。为利用丹参药渣工业化制备丹参酮ⅡA 奠定了基础。