长链非编码RNA LINC00261 在结直肠癌中的表达及其临床意义

李敏，李忠信，杨会举#

1 河南中医药大学第三附属医院肛肠科，郑州450000

2 漯河市临颍县第二人民医院肛肠科，河南 漯河4620000

结直肠癌是中国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率呈逐年上升趋势。结直肠癌的发生发展是一个多步骤、多因素的过程，目前尚不清楚其发病机制。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类转录体长度大于200 nt 的RNA，不编码任何蛋白质。研究发现，lncRNA 在细胞周期调控、表观遗传调控、转录调控、转录后调控等生物学过程中发挥着重要作用，尤其是在恶性肿瘤的发生发展过程中。LINC00261 是一个位于20p11.21 上的基因间lncRNA，LINC00261在多种肿瘤中起着促癌基因的作用。Fan 等发现LINC00261 在胃癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织，并能上调Slug 蛋白的表达，从而促进胃癌细胞上皮-间充质转化进程。抑制LINC00261 表达可促进结直肠癌细胞凋亡，并增加对化疗药物顺铂的敏感性。然而，目前尚不清楚LINC00261在结直肠癌中的作用，因此本研究拟探讨lncRNA LINC00261 在结直肠癌中的表达及其临床意义，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017 年7 月至2020 年7 月于河南中医药大学第三附属医院接受手术切除术的86 例结直肠癌患者。纳入标准：均经病理组织学诊断为结直肠癌。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②术前已接受过放疗、化疗等其他治疗干预。86 例结直肠癌患者中，男47 例，女39 例；年龄35～75 岁，平均（58.26±11.63）岁；根据世界卫生组织（WHO）组织学标准，低分化31 例，中分化42 例，高分化13 例；美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）TNM 分期：Ⅰ期18 例，Ⅱ期44例，Ⅲ期24 例。收集86 例结直肠癌患者术中留取的结直肠癌组织及癌旁组织石蜡标本。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 原位杂交技术检测结直肠癌组织及癌旁组织中LINC00261 的表达

按照原位杂交试剂盒（购自武汉博斯特有限公司）说明书进行操作，石蜡切片经常规脱蜡、水合，用焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水冲洗3 次，每次5 分钟，然后在室温下用3%过氧化氢处理10 分钟，以消除内源性过氧化物酶，用DEPC 水冲洗3 次，逐滴添加30 µl 用3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶，37 ℃孵育20 分钟，DEPC 水冲洗3次，1%多聚甲醛室温下固定10 分钟，DEPC 水冲洗3 次，然后将20 µl 预杂交溶液逐滴添加到每个切片中，并在37 ℃孵箱中进行预杂交，2～4 小时后添加20 µl 探针杂交溶液（购自武汉博斯特有限公司），37 ℃孵育过夜。次日，使用由高到低浓度的柠檬酸钠缓冲液进行梯度洗脱，除去多余的探针，然后向切片中滴加50µl 封闭液，在37 ℃环境下封闭30 分钟，然后逐滴添加50µl 生物素化的小鼠抗人地高辛抗体，并在37 ℃环境下孵育120 分钟，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）冲洗3次，每次5 分钟，滴加50 µl 链球菌亲和素-生物素复合物，在37 ℃环境下孵育30 分钟，PBS 冲洗3次，逐滴添加生物素化过氧化物酶50 µl，在37 ℃环境下孵育30 分钟，PBS 冲洗3 次，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色5 分钟，苏木素复染，干燥透明后，用中性树脂封片。

1.3 评价标准

以探针杂交溶液替换为无探针杂交前溶液作为阴性对照，随机选取5 个高倍视野（×400），采用免疫组织化学染色，根据染色强度计分：细胞无染色，计0 分；细胞呈浅棕色，计1 分；细胞呈棕色、无背景色或细胞呈深褐色、背景为浅棕色，计2 分；细胞呈深褐色，无背景色，计3 分。按阳性细胞占比计分：无阳性细胞，计0 分；阳性细胞占比≤25%，计1 分；25%﹤阳性细胞占比﹤50%，计2 分；阳性细胞占比≥50%，计3 分。二者之积为最终得分，即0～1 分为阴性，2～3 分为弱阳性，4～7 分为阳性，≥8 分为强阳性。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 LINC00261 在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达情况

LINC00261 在结直肠癌组织中阳性表达率为62.79%（54/86），明显高于癌旁组织的8.14%（7/86），差异有统计学意义（

χ

=53.751，

P

﹤0.01）。（图1）

图1 原位杂交技术检测LINC00261在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达情况（HE染色，×400）

2.2 不同临床特征结直肠癌患者结直肠癌组织中LINC00261 表达情况的比较

不同分化程度、TNM 分期、是否发生淋巴结转移的结直肠癌患者结直肠癌组织中LINC00261 阳性表达率比较，差异均有统计学意义（

P

﹤0.05）；不同年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤直径的结直肠癌患者结直肠癌组织中LINC00261 阳性表达率比较，差异均无统计学意义（

P

﹥0.05）。（表1）

表1 不同临床特征结直肠癌患者结直肠癌组织中LINC00261 表达情况的比较（n=86）

3 讨论

结直肠癌的发病率和病死率都很高，而且近年来呈年轻化趋势增长。早期结直肠癌手术加放化疗治愈率高，但复发和转移的结直肠癌仍然很难治愈，因此，迫切需要新的早期诊断、预测预后的标志物。

lncRNA 与肿瘤的发生和发展关系密切，越来越多的证据表明，失调的lncRNA 与肿瘤的发病、复发和预后不良有关，可作为肿瘤早期诊断的新型生物标志物。LINC00261 是近年来新发现的一种与多种肿瘤发生发展有关的lncRNA。在乳腺癌细胞中，沉默LINC00261 可显著抑制细胞增殖、迁移和侵袭，诱导G/G期阻滞，促进细胞凋亡，抑制细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin-dependent kinases 2，CDK2）、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、MMP9、神经钙黏素（N-cadherin）表达，增强上皮钙黏素（E-cadherin）表达。在人胰腺癌和人肺癌细胞系中，抑制LINC00261 表达可抑制细胞的侵袭和迁移能力。上述研究表明，LINC00261 影响肿瘤的发生和发展。然而，目前尚不清楚LINC00261 在结直肠癌中的作用。

本研究应用原位杂交技术检测lncRNA LINC00261 的表达，原位杂交是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术，其具有较高的灵敏度和特异度，可作为半定量检测方法。本研究结果显示，LINC00261在结直肠癌组织中阳性表达率为62.79%（54/86），明显高于癌旁组织的8.14%（7/86），差异有统计学意义（

P

﹤0.01）。表明LINC00261在结直肠癌组织中的表达水平明显升高，与结直肠癌的发生有关，这可能是由于高表达的LINC00261 抑制相关蛋白的合成，进而导致细胞生物学功能的改变，最终使细胞发生癌变。本研究进一步分析了不同临床特征结直肠癌患者癌组织中LINC00261 表达情况，结果发现，不同分化程度、不同TNM 分期、是否发生淋巴结转移的结直肠癌患者癌组织中LINC00261 的阳性表达率比较，差异有统计学意义（

P

﹤0.05），即分化程度越低、TNM 分期越高、有淋巴结转移，则结直肠癌患者癌组织中LINC00261 阳性表达率越高，其中分化程度、TNM 分期是肿瘤恶性生物学行为的表现，且淋巴结转移是结直肠癌患者预后不良的重要指标，提示LINC00261 的异常表达可能预示着结直肠癌患者预后不良。由此，LINC00261 有可能作为预测结直肠癌患者不良预后的潜在生物标志物。

综上所述，LINC00261 在结直肠癌组织中的表达明显升高，与结直肠癌的分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关，其有可能成为结直肠癌潜在的诊断标志物。本研究在今后也将扩大样本收集量，以进一步确认LINC00261 表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系，并对相关机制进行深入研究。