环状RNA作为生物标志物在急性髓细胞性白血病中的研究进展△

李明德，陈铭，姜辉，周秋梅，卜素，霍星星#

1安徽中医药大学第一附属医院临床研究实验中心，合肥 230031

2安徽医科大学第二临床医学院麻醉学，合肥230031

急性髓细胞性白血病（acute myelogenous leukemia，AML）是一种表现为未成熟的髓系细胞异常增生的血液系统恶性肿瘤。2019年美国白血病新发61 780例，病死22 840例，其中AML占较大比例。AML的发病机制目前尚不完全清楚，多项关于血液系统恶性肿瘤的研究表明环状RNA（circular RNA，circRNA）可能通过吸附微小RNA（microRNA，miRNA）调控肿瘤细胞的发生发展与耐药。因此，阐明AML致病及耐药相关基因的分子机制，寻找潜在有效的AML生物标志物，对于改善AML预后尤为重要。circRNA是一类闭合环状非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA），没有5'-帽和3'-多聚腺苷酸尾，初次发现于类病毒，长期以来被认为是RNA异常剪接的副产物，无特定的生物学功能。现已发现在真核生物中，circRNA可参与机体生长、衰老等多项生物进程。此外，circRNA的异常表达已在AML和多种肿瘤组织中被证实。本文总结了circRNA在AML中的功能作用和研究进展。

1 circRNA概述

1.1 circRNA来源与结构特点

circRNA由RNA聚合酶Ⅱ合成，受剪接因子、顺式作用元件、反式作用因子和表观遗传变化等多种因素的调控。目前，关于circRNA的生物起源已有多种假说：①前体mRNA（precursor messenger RNA，pre-mRNA）发生外显子跳读，形成套索结构并环化，产生circRNA；②pre-mRNA上通过小核糖体蛋白依次剪接加工后形成环状结构；③pre-mRNA上相邻的剪接位点被RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）调控形成circRNA；④前体tRNA（precursor transfer RNA，pre-tRNA）经过tRNA剪接核酸内切酶复合物切割，其中内含子末端被拼接形成tRNA内含子环状RNA（tRNA intronic circular RNA，tricRNA）。circRNA主要位于细胞质，也可储存于外泌体中，其闭合的环状结构与大多ncRNA不同，可不受核酸外切酶的影响。

1.2 circRNA分类

目前，基于circRNA 形成机制，主要分为三大类：外显子circRNA（exonic circRNA，EcircRNA）、内含子circRNA（circular intronic RNA，ciRNA）和外显子-内含子 circRNA（exon-intron circRNA，EIcircRNA）。EcircRNA主要定位于细胞质，其功能的发挥通过与miRNA或RBP的相互作用实现。相比EcircRNA，主要位于细胞核的ciRNA和EIcircRNA与miRNA结合位点较少。

1.3 circRNA生物学功能

circRNA生物学功能多样，尚不完全清楚，目前主要有四种功能：①作为miRNA海绵；②作为转录调控因子；③作为蛋白质适配器，通过与蛋白质结合，circRNA可被激活并发挥调节作用；④作为蛋白质翻译载体，现已发现，包含开放阅读框的circRNA具有翻译潜能，例如，circ-ZNF609含1个开放阅读框，可以通过剪接依赖和非依赖帽子机制翻译成蛋白质。

2 circRNA在血液系统中的作用

circRNA在全血、血小板、外泌体等血液系统相关细胞组分中广泛表达，其与机体的发育、衰老和相关疾病进程密切相关，在血液系统的调控中发挥关键作用。全血包含了血细胞和血浆所有成分。研究表明，血液成分或全血中存在大量的circRNA，其可能作为重要靶点影响疾病的进程，也可能作为生物标志物为诊断提供依据。Qian等发现circRNA在人外周血单核细胞中大量表达。Zhao等结合RNA微阵列分析数据，提出hsa_circ_0124644可能作为冠心病诊断生物标志物的观点。因此，全血中circRNA的异常表达可预示某些疾病的发生与进展。血小板是一类体积小且形状不规则的细胞碎片，来源于成熟巨核细胞，在止血、凝血和血管生成中起到重要作用。Alhasan等培养的成熟血小板中circRNA的相对比例显著高于巨核细胞，几种不同的circRNA也在血小板中被鉴定。然而，有关血小板中circRNA在血液系统恶性肿瘤中的研究仍较少，需要深入了解血小板中circRNA与miRNA和mRNA的相互作用关系，以为治疗提供新的思路。目前，外泌体已成为细胞间信息传递的新媒介并受到日益关注。血浆中的外泌体是一类包含核酸和蛋白质的盘状双层脂膜囊泡，可来源于多种血液细胞及肿瘤细胞。在血小板源的囊泡（外泌体和微囊）中，包裹着大量的circRNA，后者通过外泌体转运至受体细胞，调控受体细胞的生物活性。

3 circRNA与AML

circRNA可通过结合miRNA参与AML的转录后调控，激活下游信号级联，调控相关基因的表达。circRNA与AML的各项进程密切相关，可能作为AML诊疗的新靶点。

3.1 circRNA作为潜在的诊断和预后标志物

hsa_circ_0000370是由FLI-1基因衍生而来的一种新的环状circRNA，FMS样酪氨酸激酶-3（FMS-like tyrosine kinase-3，FLT3）来自Ⅲ型酪氨酸激酶受体亚家族，FLT3内部串联重复序列（FLT3 internal tandem duplication，FLT3-ITD）突变预示AML预后不良和复发风险增加。Zhang等首次报道circ_0000370在FLT3-ITD突变阳性AML中显著升高，体外研究证实circ_0000370的过表达显著抑制细胞凋亡，提高肿瘤细胞存活率，表明circ_0000370可促进AML进展。TargetScan和KEGG结果显示，circ_0000370通过负调节miRNA-1299，调控S100钙结合蛋白A7A（S100 calcium binding protein A7A，S100A7A）基因的表达，影响AML的发展，S100A7A的上调也显示不良预后。因此，circ_0000370-miRNA-1299-S100A7A轴与AML密切相关，circ_0000370可能是调控AML的关键基因。

hsa_circ_0001947是长度为861 bp的circRNA，来源于AF4/FMR2家庭成员2（AF4/FMR2 family member 2，AFF2）基因的外显子，其定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）产物中存在预期大小的头尾剪接结构，具有较强的稳定性。AFF2由22个外显子组成，具有复杂的可变剪接模式，参与细胞黏附、胶原生物合成和神经元发育等多种生物学过程。Han等发现hsa_circ_0001947在新发和复发难治性AML患者中表达下调，且与AFF2 mRNA、CREB3调节因子（CREB3 regulatory factor，CREBRF）mRNA的表达呈正相关，提示hsa_circ_0001947可能与AML的发生发展有关。hsa_circ_0001947可通过吸附hsa-miRNA-329-5p调节hsamiRNA-329-5p靶基因CREBRF的表达，影响AML的进展。研究表明hsa-miRNA-329-5p与Toll样受体途径和凋亡相关途径相关。因此，hsa_circ_0001947可作为AML的预后生物标志物，在AML进展中起重要作用，为AML的治疗提供新的见解。

hsa_circ_0121582是序列长度为769 bp的circRNA，由线性糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）外显子1到外显子7反向剪接形成。Chen等发现AML细胞质和细胞核中显著低表达的circ_0121582将导致不良预后。WNT/β-catenin途径相关蛋白异常表达是多数AML发生和发展的必要条件。circ_0121582可调节miRNA-224使GSK-3β表达增加，负调控该通路相关蛋白表达，抑制AML细胞增殖。β-catenin作为WNT信号转导中枢介质，在AML细胞中表达增加，发生去磷酸化和核转位。因此，circ_0121582可能通过miRNA-224作用于GSK-3β，抑制WNT/β-catenin信号通路，抑制AML的发展。增加circ_0121582的表达可能是治疗AML的重要方法。

circ-ANXA2是一种新的环状RNA，Ding等研究发现，circ-ANXA2在AML细胞系中表达上调，敲除circ-ANXA2表达，可能是通过增加THP-1和KG-1细胞中miRNA-23a-5p和miRNA-503-3p的表达，诱导THP-1和KG-1细胞凋亡，抑制细胞增殖。因此，circ-ANXA2可作为关键靶点，为AML的临床治疗提供新思路。

叉头框蛋白 O3（fork head box O3，FOXO3）基因是来自叉头框基因家族的肿瘤抑制基因，可参与调节人体的新陈代谢和细胞周期等进程。circ-FOXO3由FOXO3基因编码，通过p53和p53上调凋亡调控因子（p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）信号通路促进细胞凋亡。Zhou等发现接受初次治疗的AML患者中circ-FOXO3和FOXO3的表达量显著低于健康人群，提示circ-FOXO3可能作为AML的预后指标。此外，Spearman相关性分析发现circ-FOXO3和FOXO3呈正相关。上述信息提示circ-FOXO3与AML的预后密切相关，可能作为AML的治疗靶点。

circ_0009910是来源于线粒体融合蛋白-2的外显子circRNA，定位于1号染色体的12049221～12052747区段。Ping等发现，与正常对照相比，circ_0009910的表达量明显升高，其高表达与AML患者的风险增加和预后不良密切相关。降低circ_0009910表达可通过miRNA-20a-5p影响AML细胞增殖。

环状RNA MYB原癌基因样2（circular RNA MYB proto-oncogene like 2，circMYBL2）来自细胞周期检查点基因MYBL2的pre-RNA的反向剪切，长度为554 nt，涉及参考基因组hg38的外显子8～9区域。Sun等发现circMYBL2在FLT3-ITD突变阳性的AML中表达量升高，circMYBL2的低表达特异性抑制FLT3-ITD突变阳性AML细胞的增殖并促进其分化，使FLT3激酶表达水平显著降低，触发FLT3-ITD信号转导。此外，多聚嘧啶区结合蛋白 1（polypyrimidine tract binding protein 1，PTBP1）的低表达抑制circMYBL2诱导的FLT3蛋白表达水平的增加，表明circMYBL2对FLT3的调节依赖PTBP1。因此，circMYBL2-PTBP1轴可能通过促进FLT3/FLT3-ITD蛋白质翻译调节FLT3-ITD AML的进展。circMYBL2可能在FLT3-ITD突变型AML中发挥重要作用。

3.2 circRNA作为影响耐药性的重要靶点

circPAN3起源于PAN3基因的13q12染色体上，其蛋白产物是PAN2/PAN3复合体的调节亚单位，与AML的复杂核型密切相关，已引起广泛关注。Shang等发现circPAN3在AML耐药细胞株中表达增加，其机制可能是通过促分裂原活化的蛋白激 酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/MTOR途径实现。沉默AML细胞中circPAN3基因后，其化疗敏感性显著提高，GO和KEGG分析表明circPAN3与miRNA-183和X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）呈负相关。miRNA-183促进白血病细胞由G期向S期转化，防止细胞凋亡。XIAP是一类拮抗细胞凋亡的蛋白，可通过转录后调控作用受到circPAN3的影响。因此，在化疗耐药的AML患者中，circ-PAN3-miRNA-183-miRNA-153-XIAP轴与AML细胞的增殖有关，circPAN3可能是耐药AML的有效治疗靶点。

hsa-circ-0000978和hsa-circ-0000483是两个新发现的circRNA。Li等构建了耐多柔比星的HL-60细胞株，通过高通量测序和生物信息学分析，筛选出1824个差异表达的circRNA，并构建了AML耐药相关的ceRNA网络，最终筛选出hsa-circ-0000978和hsa-circ-0000483作为AML耐药相关的circRNA，可作为AML耐药的潜在靶点，但具体作用机制仍有待探讨。

4 小结与展望

目前，circRNA的研究已成为热点，多项研究表明，circRNA可作为miRNA的作用靶点、转录调节因子、蛋白质接头和蛋白质翻译因子，通过吸附miRNA发挥各种调控作用。但与其他线性RNA相比，circRNA的研究仍只是冰山一角，很多问题亟待解决：①缺乏统一的数据库和具体的命名标准；②缺乏对circRNA功能的良好注解；③缺乏规范可行的circRNA检测技术；④缺乏对circRNA相关调控机制的明确理解；⑤circRNA作为AML生物标志物的可行性仍需实验验证等。随着越来越多的circRNA被发现与鉴定，其在AML中的功能和作用机制也将逐渐清晰。