肿瘤标志物检测方法的研究进展

唐玉秀，闭雄杰

1广西科技大学第二附属医院检验科，广西 柳州545006

2广西科技大学第一附属医院检验科，广西 柳州5450060

肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下形成的新生物，涵盖了不同的肿瘤种类，具有不同的病理类型、检查和治疗方法。肿瘤标志物指恶性肿瘤细胞分泌或脱落到体液或组织中的物质，可以反映肿瘤存在和生长情况，或被认为是宿主响应肿瘤而产生的肿瘤衍生产物[1]。肿瘤标志物检测多数情况下具有高特异度和灵敏度，但不同的检测方法会有明显的差异[2]。目前肿瘤标志物的检测方法仍存在较多难点，通过简单易用的实验室测试，可以检测或验证肿瘤的存在。临床肿瘤标志物检测具有无创、易于获取标本、操作方便、易于动态监测疾病、成本低等优点[3]。对肿瘤的早期诊断、鉴别诊断、疾病监测、病理分型、指导治疗和预后评估具有重要意义。临床上，不同的肿瘤对肿瘤标志物的灵敏度和特异度不同，因此，检测方法也有很大差异。本文对免疫学方法、液体活组织检查和外泌体检测三类常用的肿瘤标志物检测方法进行综述，为临床肿瘤标志物检测方法的选择提供参考依据。

1 免疫学方法

肿瘤标志物主要包括蛋白质、激素、酶、多胺及基因产物等，集中分布在血液、体液、细胞或组织中，可以通过不同针对性的生化、免疫学及分子生物学等方法进行测定，对肿瘤的辅助诊断、鉴别、监测病情、疗效及预后评估具有十分重要的临床价值。

1.1 放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）

RIA是一种检测肿瘤标志物的传统方法，通过使用高灵敏度、准确度和未标记抗原的放射性同位素测量结合抗体特异性或竞争性抑制反应来定量体外微量物质的分析方法[4]。一般来讲，涉及使用免疫学测定的技术可称为RIA，只要涉及放射性同位素标记的抗原或抗体均可称为RIA，包括竞争性RIA和非竞争性RIA。放射免疫分析使用放射性核素125I，因其具有放射性高、易于标记和易于检测衰变期间释放的辐射的优点而被广泛使用，并逐渐取代了3H和14C。RIA具有以下五方面优点[5-6]：①可以测量多种免疫活性物质；②高灵敏度，一般化学分析的检出限为（10-9～10-15g）；③由于抗原-抗体免疫反应的特异性，特异度较高；④RIA应用广泛，据不完全统计，已为RIA建立了至少300种生物活性物质，可以用于几乎所有的激素、各种蛋白质、肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、一些小分子（如环核苷酸）和药物（如地高辛、毛地黄等）的分析，且范围申请仍在扩大；⑤RIA是一种体外分析技术，试剂少、样品用量少、反应时间短、操作简单、对患者无辐射危害、易于自动化。但RIA也具有以下五方面不足[5-6]：①只能测量具有免疫活性的物质；②生物制剂的稳定性受多种因素的影响；③对某些含量极低的物质检测灵敏度较低；④测量值是相对数量而不是绝对数量；⑤存在辐射和污染等问题。虽然RIA存在一些缺点，但随着科学技术的进步，RIA作为一种定量分析方法将得到更广泛和更深入的发展。

1.2 化学发光免疫测定（chemiluminescence immunoassay，CLIA）

CLIA是一种常用且相对成熟的肿瘤标志物检测技术[7]。CLIA是一种将高灵敏度的化学发光测量技术和高特异性的免疫反应结合的检测和分析技术。CLIA是继RIA、无酶检测、荧光免疫测定和时间分辨荧光免疫测定后的最新的免疫检测技术。CLIA具有灵敏度高、检测速度快、线性范围宽、仪器结构简单、适合小型化和无放射性危害的优点。CLIA采用发光物质（如吖啶酯）或酶催化剂[如辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）]直接标记抗体以标记抗原抗体[7]。CLIA与微芯片电泳分离及化学发光检测技术相结合，具有检测效率高、分析速度快、自动化程度高、样品和试剂少的优点。Min等[8]研究观察显示，化学发光强度与铁蛋白浓度在5.1～1300.0 ng/ml间呈线性关系，检出下限为2.55 ng/ml。同时，CLIA的整个过程可以在45 min内完成，这种具有自动化和定量功能的芯片实验室化学发光免疫测定平?台为多种肿瘤患者即时检测肿瘤标志物提供了一种有前途的策略。

传统化学免疫测定系统中使用的天然酶具有稳定性差、来源有限、对环境变化敏感及易受环境影响而变性的缺点，且标记过程中通常可损害抗体分子的生物活性。近年来，无酶免疫系统的发展将电化学技术和化学发光结合来检测肿瘤标志物，同时具有化学发光和电化学的优点。Yang等[9]研究结果显示，一种新型的无CuS纳米颗粒的CLIA被设计用于测定线性范围为0.1～60.0 ng/ml且检测下限为0.07 ng/ml的甲胎蛋白，该技术具有操作简单、价廉、快速的特点，特异度高，且具有可接受的重复性和良好的准确性。

1.3 酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是在固相载体上吸附已知抗原或抗体，并在抗原-抗体复合物中加入酶标抗原或抗体用于抗原-抗体反应[10]。改变抗体的免疫学特性不会影响酶的生物活性，并且酶是由底物发展而来的，从而达到检测目的。常用的ELISA方法是双抗体夹心法（检测大分子抗原）和间接法（确定特异性抗体）。用于标记抗体或抗体的酶必须具有高活性和高灵敏度、在室温下稳定、反应产物易于观察、可以商业化生产的特征[11-12]，包括HRP、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中HRP的使用最广泛。不同的研究方案将选择不同的ELISA策略，如使用单克隆、多克隆抗体和嵌合抗体来开发肿瘤标志物检测试剂盒。ELISA开发后，其检测系统也进行了不同程度的优化，如凝集素和生物素-抗生物素蛋白系统在ELISA中的应用极大地增强了其检测的灵敏度[11]。此外，ELISA系统也不断提高相关肿瘤标志物检测的灵敏度。除ELISA外，更多具有酶活性的模拟酶的研究正在进行。Zhang等[13]使用夹心型比色法在可见光下改变3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethyl benzidine，TMB）的颜色，并通过TMB溶液水平的颜色变化量化癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）。该方法在血清样品分析中显示出了良好的选择性、重复性和稳定性。Aggarwal等[14]通过ELISA验证了所选择的生物标志物，即α-1抗胰凝乳蛋白酶（α-1-antichymotrypsin，ACT）、触珠蛋白（haptoglobin，HAP）和视黄醇结合蛋白（retinol-binding protein，RBP），结果显示，活动性肾病患者的ACT水平高于其他组患者，且与肾脏系统性红斑狼疮疾病活动指数（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）有很好的相关性；同时，该研究中活动性肾病患者的HAP水平高于其他组患者的10倍以上；治疗后，ACT、HAP、RBP水平比治疗6、12个月时降低；多元Logistic回归分析结果显示，ACT是区分活动性肾病和SLEDAI的最佳标志，尿液中的HAP、ACT和RBP是狼疮肾炎活动的潜在生物标志物。

2 液体活组织检查

液体活组织检查，即液体活检，是体外诊断的一个分支，指使用无创血液检测技术来监测肿瘤或转移瘤释放到血液中的循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）和外泌体等，是用于检测肿瘤和辅助治疗的突破性技术[15]。既往临床没有对液体活检给予足够重视，且没有发现其潜在的应用价值。随着研究深入，CTC的潜在应用价值逐渐被人们发现，液体活检的研究呈爆发性增长，现已逐渐应用于临床。与组织活检相比，液体活检可以早期筛查和监测肿瘤标志物，具有无创、易取样、操作简便和实时监测等优点，但存在检测费用较高且没有统一的检测标准等不足。Zhang等[16]的研究表明，CTC、ctDNA和外泌体检测优势明显，作为一种非侵入性检测方法，可以在治疗前、治疗期间和进展期间提供诊断和预后信息。Rolfo等[17]研究表明，液体活检是非侵入性的检测方式，应用前景广阔，在临床中可方便快捷的立即实施。Cohen等[18]对66例胰腺导管腺癌患者采用无创血浆液体活检，探讨多个肿瘤标志物联合检测是否优于任何单个标志物，结果发现，30%的患者存在鼠类肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）突变，血浆中发现的每个突变均与患者原发肿瘤中发现的突变相同（一致性100%）。联合检测KRAS与4个阈值蛋白质，即CEA、糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和骨桥蛋白（osteopontin，OPN）可将检测灵敏度提高至64%。

2.1 CTC

在原发性乳腺癌、肝癌、结肠癌和前列腺癌等的形成和生长早期，肿瘤细胞从原发性肿瘤脱落，然后进入血流循环形成CTC。临床可利用这些CTC不同的物理和生物学特性采用不同的技术来富集和检测。CTC分析被认为是肿瘤患者的实时“液体活检”。CTC的检测和分子表征是肿瘤转化研究中最活跃的领域之一，超过400项临床研究将CTC作为生物标志物[11,19]。CTC主要采用免疫组化法，近年来，多种改进CTC检测方法的创新技术逐渐应用于临床，包括CTC微芯片、过滤装置、定量逆转录PCR分析和自动显微镜系统。但分子特征研究表明，CTC有很强的异质性，这一发现强调需要多种方法来捕获所有相关的CTC子集[19]。越来越多的证据表明，CTC能够实时反映肿瘤进展，且这些信息在全身治疗的背景下可能特别有用。预计CTC有助于在特定治疗窗口内向特定的肿瘤患者群体指导特定的靶向治疗，是个体化医疗的标志。Busetto等[20]为评估CTC对155例高危非肌肉浸润性膀胱癌患者的预后评估价值，并评估两种不同CTC分离方法的疗效和可靠性，平均随访28个月的结果显示，65例（41.9%）复发，27例（17.4%）疾病进展，9例（5.8%）淋巴结和（或）骨转移，其他正常。在对CTC的分析中，Cell Search自动化系统（A组）阳性患者20例（19.8%），CELLection Dynabeads手动系统（B组）阳性患者24例（44.4%）；CTC阳性与首次复发时间密切相关，A组CTC阳性患者的复发率为75%，B组CTC阳性患者的复发率为83%；此外，疾病进展时间也与CTC密切相关。表明CTC可作为高危非肌肉浸润性膀胱癌患者危险分层和预后的潜在标志物，以预测疾病复发和疾病进展。Arnoletti等[21]的研究结果显示，壶腹周围病变、壶腹腺癌和远端胆管癌患者的CTC增殖能力较高，并对凋亡具有抵抗力，在接受术前化疗的壶腹周围病变、壶腹腺癌和远端胆管癌患者中，壶腹周围病变患者的CTC明显增殖且对T细胞细胞毒性的抵抗力明显降低。培养7天后，来自胰腺导管腺癌、远端胆管癌和壶腹腺癌患者的CTC募集了多种免疫细胞类型，包括CD105+CD14+髓样成纤维细胞，以组织成类球体簇。只有在壶腹腺癌和远端胆管癌衍生的混合细胞反应培养物（mixed cell reaction cultures，MCR）中，簇形成才能促进CTC存活、生长和成纤维细胞分化。流式细胞仪消耗了CTC或髓样成纤维细胞，消除了簇网络的形成，而这些细胞群体的重新引入又重新构建了这种能力。该研究结果表明，胰腺导管腺癌、远端胆管癌的CTC在门静脉循环内的生存与多细胞类型簇内的免疫细胞的相互作用得到支持，这些簇可以作为局部复发和转移性进展的载体。

2.2 ctDNA

对肿瘤组织进行基因分型以寻找可操作信息的体细胞遗传改变已成为临床肿瘤学的常规实践。虽然这些序列改变具有很高的信息量，但肿瘤组织取样具有明显的内在局限性，这是因为肿瘤组织仅提供肿瘤异质性的快照，受到肿瘤异质性引起的选择偏倚，并且可能难以获得。经过细胞凋亡或坏死的细胞将DNA的无细胞片段释放到血液中，且ctDNA的负荷与肿瘤分期和预后相关[22]。虽然ctDNA具有易降解、含量低等缺点，但DNA分析的灵敏度和准确度研究的最新进展，允许改变肿瘤中发现的体细胞基因组从而进行ctDNA基因分型。检测和量化肿瘤突变的能力可有效地实时追踪肿瘤动态，并用作液体活检，应用于既往不可能的各种临床和研究。

在肿瘤学中，检测源自ctDNA具有三个主要原因，包括从正常ctDNA中区分ctDNA，存在有时极低水平的ctDNA，以及样品中突变片段数量的准确定量[23]。通过突变来定义肿瘤DNA的存在有助于区分正常和肿瘤ctDNA。这些体细胞突变，通常是单碱基对的替换，仅存在于肿瘤细胞或癌前细胞的基因组中，且不存在于同一个正常体细胞的DNA中。这确保了ctDNA作为生物标志物的精细生物学特异性。因此，若肿瘤DNA片段在肿瘤患者的循环中丰富，则使用所有识别体细胞突变的DNA测序方法来鉴定ctDNA均较容易。不幸的是，检测源自肿瘤的ctDNA存在很大的挑战，主要是因为ctDNA通常仅占总ctDNA的1.0%。由于数字基因组技术允许在复杂的DNA混合物中计数罕见的突变体，因此，近期临床对肿瘤患者ctDNA的研究逐渐增多。Schwaederlé等[24]为确定非小细胞肺腺癌患者血液ctDNA的基因组变化，对88例晚期肺腺癌患者进行了全面的血清ctDNA检测，34例患者进行了下一代测序，25例没有进行组织分子检测，结果显示，72例（82%）患者的ctDNA基因改变数量≥1，最常见的改变依次为TP53（44.3%）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）（27.3%）、MET（14.8%）、KRAS（13.6%）和间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）（6.8%）基因。对于任何可检测ctDNA改变的晚期肺腺癌患者，EGFR改变的一致性率为80.8%（ctDNA和组织测试之间100%vs61.5%，P=0.04）。25例患者（28.4%）接受了匹配≥1 ctDNA改变的治疗，结果显示，22例可评估患者中，72.3%（16/22）的患者实现了≥6个月的疾病稳定或部分缓解。随后采用第三代EGFR抑制剂治疗了5例经ctDNA检测的EGFRT790M突变患者，所有患者均达到≥6个月的疾病稳定或部分缓解。变异等位基因数量≥1且变异等位基因分数≥5%患者的中位生存期明显短于编译等位基因分数＜5%的患者（P=0.012）。Riva等[25]调查了非转移性三阴性乳腺癌患者ctDNA检测对新辅助化疗的评估价值，并在手术后检测出最少的残留肿瘤组织，结果发现，依据液滴数字聚合酶链反应（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）制定的ctDNA检测在基线时即可达到75%的检测率。在新辅助化疗期间，ctDNA水平迅速下降，且术后未发现最小的残留病，但新辅助化疗期间ctDNA水平的缓慢降低与较短的生存期密切相关。

2.3 外泌体检测

外泌体是“生物活性囊泡”的最新家族成员，来源于多泡体与质膜的融合，以及管腔内囊泡的细胞外释放，可促进细胞间通讯[16]。最近的研究多集中于外泌体的生物发生和组成，以及对外来体释放的调节。研究已经证实，外泌体由造血和非造血来源的细胞释放，但其功能仍不清楚。另一项研究表明，外泌体也可能促进感染因子的细胞间传播[26]。此外，从感染了各种细胞内病原体（包括结核分枝杆菌和弓形虫）的细胞中分离的外泌体，显示含有微生物成分且可以促进抗原呈递和巨噬细胞活化，表明外泌体可以在免疫监视中起作用[27]。Bach等[28]发现，原发性肿瘤微环境中，肿瘤组织分泌的外泌体和miRNA可以被其他细胞类型内化，这些外泌体中装载的miRNA可能会转移到受体利基细胞中，从而对基因表达进行全基因组调控。在肿瘤微环境下，外泌体miRNA如何促进耐药性的发展尚未得到充分描述。Cheng等[29]研究表明，外泌体是通过穿梭货物（如蛋白质、脂质、RNA、双链DNA、非转录RNA和miRNA）转运到肿瘤细胞、基质细胞和细胞外基质成分中转移的介质，这种现象在肿瘤发生和耐药性中均已表明。同时引入的外泌体提取的新方法，注重在卵巢癌外泌体的作为生物标志物和化疗靶点的新兴作用，并探讨其潜在的临床应用价值。

3 分子生物学方法

分子生物学是在分子水平上研究生物大分子的结构和功能，以解释生命现象。分子生物学具有灵敏度高、特异性强、通量高等特点，但检测周期长、成本高。分子生物学的主要研究领域是蛋白质系统，蛋白质-核酸系统/脂质系统（即生物膜）[30]。目前，用于检测肿瘤标志物的分子生物学技术包括PCR、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）和逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）。

PCR是一种广泛使用的体外扩增DNA技术，具有简便、灵敏、高效、高特异度和快速性的特点。通过经典PCR开发的技术，如RT-PCR、扩增融合PCR和实时荧光定量PCR等通常用于检测肿瘤，如肺癌、结肠直肠癌和乳腺癌[31]。此外，甲基化特异性PCR对DNA甲基化检测的灵敏度较高。Lan等[32]研究发现，甲基化特异性PCR检测胃癌标志物的检出率明显高于RT-PCR。FISH是将标记的探针与单链核酸片段配对，并在非放射性分子生物学和细胞遗传学下使用原位杂交，通过荧光标记的取代同位素观察靶序列的分布。尽管FISH是一种低通量测试，但它不需要放射性同位素标记，具有高探针稳定性、更经济、更安全及良好的特异性，定位准确，出结果快速。FISH可以显示不同的颜色，以便同时检测多个序列，且检测周期短。目前，FISH在肿瘤细胞、突变染色体和染色体重排中具有重要意义。

4 小结与展望

目前，传统的肿瘤诊断方法包括病理活检、B超、X线、计算机断层扫描（CT）、内窥镜检查和磁共振成像（MRI），但肿瘤的早期诊断受上述诊断效果的限制。部分检测方法难以应用于基层医院，且由于昂贵的检测费用增加了患者家庭的经济负担，因此，选择一种有效的肿瘤早期诊断方法十分关键，肿瘤标志物的筛选已成为肿瘤早期诊断最有价值的指标。肿瘤标志物通常分布在尿液、血清、细胞、体液或组织中，常见的肿瘤标志物包括激素、碳水化合物抗原、酶标记物、癌胚蛋白和肿瘤抗原等。随着医学技术的发展，目前，已发现了大量的具有更高灵敏度或特异度的肿瘤标志物，且出现了不同的检测方法，但每种标志物均有其自身的特征。如何整合不同的检测方法，提高肿瘤标志物检测的灵敏度、特异度和稳定性是研究人员一致探讨的难点。因此，无论使用何种材料和方法，早期检测低水平的肿瘤标志物，指导临床治疗是研究和开发所追求的最终目标。