微小RNA与胆管癌关系的研究进展

王海明，王建华

天津中医药大学附属北辰中医医院外科，天津3004000

胆管癌（cholangiocarcinoma，CCA）是来源于胆管上皮的恶性肿瘤，发病率居原发性胆道恶性肿瘤的首位，占恶性肿瘤的2%[1-2]。CCA根据解剖位置可分为肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，iCAA）、肝门周围胆管癌（perihilar cholangiocarcinoma，pCCA）和远端胆管癌（distal cholangiocarcinoma，dCCA）。CCA具有早期症状不典型、易浸润转移等特征，多数患者就诊时已为晚期，预后极差。据报道，欧洲iCCA和肝外胆管癌的5年生存率分别为5%和17%[3]。尽管近年来CCA诊断和治疗技术有所改善，但根治性手术切除或肝移植仍然是早期阶段治疗的唯一方法。目前CCA的诊断缺乏特异性生物标志物或特殊临床表现，临床治疗无有效的分子靶向制剂，这些困难主要是由于其分子发病机制尚未清楚。故为了改善CCA诊断、监测进展和预测潜在药物治疗靶点等，迫切需要阐明CCA的分子发病机制。微小RNA（microRNA，miRNA）是长度为18～25 nt的内源性、高度保守的非编码单链RNA[4]。目前研究表明，miRNA参与调控癌症的多种生物学过程，其主要是通过在转录后水平调控机体基因表达。大量研究表明，miRNA在CCA中表达失调，研究miRNA有助于进一步探索CCA的分子发病机制，为未来CCA早期诊断和治疗提供新的方向和理念。

1 miRNA在恶性肿瘤中的调控机制和作用

1.1 miRNA在机体中的调控机制

miRNA是非编码RNA的亚组，在从调控昆虫生长到哺乳动物中X染色体失活等一系列机体生物学过程中发挥着重要作用。目前研究证实，miRNA可以在细胞内和细胞外调控基因表达。细胞内miRNA通过与靶信使RNA（messenger mRNA）3'非翻译区（3'-UTR）结合，将miRNA嵌入与其相关的RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）中，并在转录后水平的基因表达中发挥重要作用，此种相互作用导致翻译抑制或mRNA降解。单个miRNA可以靶向调控数百个潜在mRNA靶标，并且单个mRNA亦可以聚集在一个以上的miRNA上。以上亦是一种特定miRNA可以调控多个基因并影响多种细胞进程的原因[5]。

miRNA不仅在细胞内调控基因表达，也可分泌出来通过缝隙连接与相邻细胞进行信息转导。部分miRNA以自由循环的方式从细胞中释放，后与载体蛋白相结合，存在于细胞外囊泡中。细胞外囊泡将miRNA、脂质和蛋白质等小分子物质运输到受体细胞，其膜通过内吞作用与靶细胞膜融合，将其内容物释放到细胞质中发挥调控作用[6-7]。目前研究表明，细胞外囊泡中某些miRNA呈选择性分泌，提示胞外miRNA可能发挥更高级的调控作用。

1.2 miRNA在恶性肿瘤发生发展中的作用

miRNA是一类小分子非编码RNA，在癌症发生发展、侵袭转移和耐药等方面均起着重要作用。据文献报道，人类超过30%的蛋白质编码基因受到miRNA调控，从而进一步控制细胞的整体生物学过程，如细胞增殖、分化和凋亡，参与肿瘤发生的动态多步骤过程。目前研究已证实，恶性肿瘤患者体内miRNA表达失调，其主要机制包括染色体异常、转录控制变化、表观遗传变化和miRNA生物发生机制缺陷。miRNA根据其靶基因，在特定条件下可以作为致癌因子或肿瘤抑制因子发挥作用。在恶性肿瘤中上调的miRNA可作为致癌因子通过逃避生长抑制因子作用并维持增殖信号转导等途径而促进肿瘤发生和进展；下调的miRNA可作为肿瘤抑制因子负向调控肿瘤。

2 miRNA在CCA中的调控机制

miRNA在CCA的发生发展过程中发挥重要调控作用，但是其机制尚不清楚。探究miRNA与CCA之间的关系可以为其发病分子机制和临床实践提供新的思路。

2.1 miRNA对CCA细胞增殖和凋亡的调控机制

肿瘤细胞的增殖和凋亡调控是肿瘤发生的关键机制之一，而miRNA可通过调节肿瘤细胞增殖或凋亡的关键基因功能而影响肿瘤发展。miRNA是调节基因表达的内源性RNA分子，体内外研究发现其在CCA细胞及组织中表达异常。目前研究已经明确，CCA细胞系中miRNA-21、miRNA-141、miRNA-26a和miRNA-200b等多种miRNA呈高表达，而miRNA-29b、miRNA-122和miRNA-590-3p等呈低表达[8-10]。有研究表明，miRNA-141靶向调控时钟基因（clock gene，CLOCK），通过调控昼夜节律和抑制肿瘤细胞分裂而促进细胞凋亡。因此，抑制miRNA-141表达可以增加CLOCK基因的表达，从而促进CCA细胞的增殖并抑制其凋亡，促进CCA的发生发展。免疫逃逸是肿瘤细胞的生物学特征之一。miRNA-29b可增加CCA细胞的抗凋亡活性[9]。Mott等[10]研究表明，miRNA-29b在CCA细胞系KMCH中通过抑制抗细胞凋亡家族成员髓细胞白血病 1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）表达，增强KMCH细胞对肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）的敏感性并诱导细胞凋亡。进一步研究发现，c-Myc和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路均可以调控miRNA-29表达，导致CCA细胞凋亡。故提高miRNA-29的表达水平可通过以上机制促进CCA细胞的凋亡，抑制CCA的发生发展。肿瘤的发生发展与细胞增殖关系密切。在CCA细胞系RBE和QBC939中，miRNA-138以转移基因Ras同源类似物C（RhoC）为靶点发挥调控作用，将miRNA-138转染入CCA细胞导致RhoC表达降低，抑制CCA细胞增殖，从而改善CCA细胞恶性进展[11]。随着研究深入发现，miRNA-421和miRNA-24分别通过调控肿瘤抑制蛋白法尼醇X受体（farnesoid X receptor，FXR）和多发性内分泌癌蛋白基因编码蛋白Menin，影响CCA细胞增殖[12-13]。

细胞周期在细胞增殖过程中发挥着重要作用，细胞周期调控失常可能导致细胞异常凋亡和增殖。Olaru等[14]通过多种实验方法证实，miRNA-494在CCA组织中呈低表达状态。流式细胞周期分析显示，miRNA-494通过调控细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶 4/6（cyclin-dependent kinase 4/6，CDK4/6）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）、细胞周期蛋白E2（cyclin E2，CCNE2）和组蛋白去乙酰化酶 1（histone deacetylase 1，HDAC1）等多个靶基因表达干扰CCA细胞G1/S周期阻滞细胞增殖。另一项研究表明，miRNA-494在CCA细胞G2/M期中起着重要的负向调控作用。蛋白质印迹法实验结果显示，miRNA-494通过调控Polo样激酶-1（Pololike kinase 1，PLK1）、垂体肿瘤转化基因 1（pituitary tumor-transforming gene 1，PTTG1）、细胞周期蛋白B1（cyclin B1，CCNB1）、细胞分裂周期蛋白2/20（cell-division cycle 2/20，CDC2/20）和拓扑异构酶Ⅱα（topoisomerase-Ⅱα，TOP2A）等多个 G2/M 期基因，致使CCA细胞延缓在G2/M期[15]。以上研究得出，miRNA-494通过影响细胞周期G1/S和G2/M期，在调控细胞增殖中发挥重要作用。miRNA与CCA分子发病机制之间存在密切关系。但目前多数研究都集中在CCA的单一时间点。Chen等[16]利用miRNA实时活性监测技术，检测了miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-21、miRNA-146a、miRNA-155和miRNA-221 6种miRNA的动态活性，结果表明，此6种miRNA的功能是暂时性的，且表达水平随时间而变化。虽然这项研究有一定局限性，但为CCA发病机制的研究提供了一新视角。

2.2 miRNA对CCA上皮-间充质转化（epithelialto-mesenchymal transition，EMT）的调控机制

肿瘤细胞的侵袭和转移是一个复杂、多步骤和动态的生物学事件。EMT被认为是肿瘤转移级联中的早期和关键步骤。目前研究证实，miRNA在肿瘤EMT中发挥着重要的作用。研究发现，miRNA-21在CCA细胞系中过表达可影响上皮标志物（E-钙黏蛋白）和间充质标志物（N-钙黏蛋白、波形蛋白）的表达，提示miRNA-21可间接或直接调控CCA细胞EMT[17]。近来研究发现，miRNA-21的表达是通过EMT信号转导途径的调控起作用，并且通过敲除QBC939细胞中miRNA-21证实，Krüppel样因子 4（Krüppel-like factor 4，KLF4）基因是其作用靶点[18]。实验表明，miRNA-204过表达可通过靶向调控SNAI2基因逆转CCA细胞EMT过程，从而抑制CCA细胞迁移侵袭[17]。miRNA-34a作为一种抑癌miRNA，可以靶向调控多种信号转导途径下游分子发挥作用。Smad同源物4（mothers against decapentaplegic homolog 4，SMAD4）是一种转录因子，是转化生长因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）信号转导的中心环节。SMAD4参与细胞增殖、分化、迁移和凋亡，介导上皮细胞与基质炎性细胞间的相互作用。研究发现，CCA组织中SMAD4和miRNA-34a在蛋白水平呈反向关系；通过细胞实验发现，miRNA-34a过表达通过TGF-β/SMAD途径靶向调控SMAD4，致使E-钙黏蛋白表达增加和N-钙黏蛋白表达减少，提示miRNA-34a通过TGF-β/SMAD途径靶向调控SMAD4抑制人CCA细胞EMT，抑制肿瘤细胞侵袭和转移。δ样蛋白1（delta like protein 1，DLL1）是Notch通路配体，miRNA-34a通过负向调控DLL1，影响肿瘤细胞EMT[19]。以上研究表明miRNA在CCA的EMT中发挥着重要调控作用。

EMT是一系列复杂的调控过程，其他转录因子和信号通路亦可参与CCA细胞EMT的发生。磷酸酶和张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）是一种重要的抑癌基因，参与EMT的调节过程。miRNA-221直接调控PTEN，后者激活β-连环蛋白，促进CCA细胞发生EMT，影响肿瘤细胞的侵袭转移[20]。miRNA-200b/c通过调节E盒锌指结合蛋白1/2（zinc finger E-box binding homeobox 1/2，ZEB1/2）-E钙黏蛋白轴促进CCA入侵，间接提示miRNA-200b/c可能影响CCA细胞EMT[21]。Li等[22]研究证实，miRNA-214直接靶向调节转录因子Twist，导致E-钙黏蛋白降低，间接影响EMT。综上，miRNA同时可以间接影响CCA的EMT。

2.3 miRNA对CCA相关致病因素的调控机制

炎症是导致肿瘤发生和进展的确切因素之一，且炎症环境可以影响肿瘤表观遗传学的改变。目前研究证实，细胞因子、生长因子、酪氨酸激酶等在炎症条件下具有促进CCA发生发展的作用。白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）是炎症相关细胞因子，通过多种机制促进肿瘤进展。Meng等[23]通过体外实验证实，miRNA let-7a通过调控信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化增强IL-6活性，且靶向调控编码肿瘤抑制基因神经纤维瘤病2（neurofibromatosis 2，NF2）基因。进一步研究发现，IL-6可通过靶向调控miRNA-370促进肿瘤生长。An等[24]通过等位基因丢失分析发现，CCA组织中miRNA let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b簇呈低表达；miRNA let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b水平升高在体内和体外可抑制CCA细胞迁移和侵袭；同时该簇通过调控IL-6受体和胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF1R）抑制IL-6/STAT3炎症途径。环氧合酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2）是前列环素形成中起关键作用的一种重要的炎性因子。miRNA-101过表达抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和COX-2表达水平，导致异种移植模型中的肿瘤生长减缓。研究发现miRNA-21靶向调控15-羟基前列腺素脱氢酶（15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase，15-PGDH），对基于前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的COX-2转化至关重要。此外，PGE2可以进一步促进miRNA-21表达形成正反馈环[25]。因此，阻断miRNA-21/COX-2/PGE2信号转导可以为治疗CCA提供有希望的治疗策略。提示miRNA可以通过多种途径调控炎性反应影响CCA。

昼夜节律调控在机体生理活动和细胞行为过程中起着重要作用，众多细胞转录组和蛋白质组以昼夜节律的方式进行。昼夜节律调节主要是通过CLOCK和NPAS2等蛋白实现的。细胞昼夜节律紊乱是多种癌症的发病风险因素。有研究通过生物信息学技术分析预测得出miRNA-141可能在iCCA中过表达，且通过靶向调控CLOCK基因发挥作用[12]。Han等[26]研究发现miRNA-34a在CCA细胞中呈节律性表达，其通过增加Per1蛋白表达水平抑制miRNA-34a进而抑制CCA细胞增殖、迁移和侵袭。提示miRNA可以通过调控细胞昼夜节律的形式影响CCA的发生和发展。

3 miRNA作为CCA预后生物学标志物

CCA恶性程度高，预后差，容易并发早期局部淋巴结转移和远处转移。临床上影响CCA患者预后的独立因素包括：肿瘤临床分期、肿瘤分化程度和手术方式等。随着对miRNA研究的深入发现，特定miRNA可以作为CCA预后判断的独立生物学标志物。Cheng等[27]通过对95例CCA患者血液标本进行检测发现，血清循环miRNA-106a的低表达水平与切除后淋巴结转移情况相关，通过Cox比例风险模型分析证实miRNA-106a表达水平是影响CCA患者总体生存率（OS）的独立预后因素。Wang等[28]通过对66例CCA患者和健康人群进行比较发现，miRNA-26a在CCA患者中较健康人群呈显著高表达（P＜0.01），且与CCA临床分期、肿瘤分化状态密切相关。血清高miRNA-26a表达水平亦是判断CCA患者OS和无进展生存的独立预测因子。Li等[29]通过对CCA组织和癌旁组织进行逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测发现，miRNA-203在CCA组织中呈低表达，且与肿瘤大小、肿瘤分化程度及临床分期密切相关；进一步分析表明，miRNA-203表达水平可作为CCA患者OS的独立影响因素。McNally等[30]研究发现，在CCA组织中miRNA-126和miRNA-151-3p表达失调，且可作为影响OS的预后标志物。尽管目前已经尝试提供相关预后miRNA谱，但是尚未在临床中大规模应用。

4 miRNA与CCA化疗耐药性

CCA多药耐药性是一个多因素过程，是由众多表观遗传因素参与的调控细胞存活和凋亡平衡的过程。研究报道，miRNA-21和miRNA-200b过表达可能影响磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/PTEN信号通路，增加吉西他滨的药物抗性[12]。体外研究发现，恢复CCA细胞系中miRNA-29b、miRNA-205、miRNA-221的表达水平可增强吉西他滨的药物敏感性，其机制可能是靶向调控磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基1（phosphoinositide-3-kinase，regulatory subunit 1，PIK3R1）和基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）。另有研究表明，miRNA let-7a靶向调控NF2可增加吉西他滨毒性[29]。miRNA-200b/c的过表达可通过靶向调控Zeste12同源物1抑制因子2（suppressorof zeste 12 homolog，SUZ12）和Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶-2（Rho-associated coiled-coil protein kinase-2，ROCK2）增加5-氟尿嘧啶对CCA细胞的敏感性。Li等[31]研究证实，miRNA-199a-3p的表达水平对顺铂条件下CCA细胞系凋亡情况具有显著影响，其主要是通过作用于雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）靶点。Asukai等[32]发现，抑制miRNA-130a-3p表达可恢复CCA细胞系对吉西他滨的药物抗性，间接表明miRNA-130a-3p表达水平可以作为预测CCA细胞对吉西他滨敏感性的标志物。

综上所述，CCA目前仍然是最致命的恶性疾病之一。近年来，miRNA在CCA发生和发展中的分子机制不断被揭示，新型分子治疗靶点被挖掘，为进一步研究CCA的发病、诊断、治疗及预后等提供了新方向，为基因治疗开拓了新思路。但是miRNA在CCA中的分子作用机制尚不明确，仍有多种新型miRNA及其机制需进一步探究。