配对盒基因8在不同类型甲状腺癌细胞中的表达及对细胞增殖及摄碘能力的影响

张昕，周作枝，崔雁飞，齐创，向东华

恩施土家族苗族自治州中心医院中西医结合肿瘤科，湖北 恩施4450000

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，包括乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌和髓样癌，其中乳头状癌恶性度较低、预后较好，甲状腺癌患者的预后与病理类型密切相关[1-2]。中国以乳头状癌和滤泡状癌较为常见，前者多发于碘充足地区，后者好发于碘缺乏地区；近年发现甲状腺癌发病率呈上升趋势，尤以女性多见[3]。研究发现，基因突变、易位及甲基化等在甲状腺癌发生发展过程中占重要地位，以上异常可通过激活肿瘤相关信号通路，诱发细胞癌变[4]。配对盒基因8（paired box 8，PAX8）位于人染色体2q12-q14，是PAX家族的重要成员之一，可限制基因转录。研究发现，PAX8对胚胎甲状腺、神经系统、肾等器官发育至关重要，在甲状腺滤泡状癌研究中呈高表达，表明其亦可参与甲状腺癌的发生发展[5-6]。但关于PAX8与甲状腺癌增殖及治疗研究少见，本研究通过构建重组质粒探讨PAX8对甲状腺乳头状癌细胞和滤泡状癌细胞增殖及摄碘能力的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂盒仪器

人正常甲状腺细胞株HTori-3、人甲状腺乳头状癌细胞株NPA87和人甲状腺滤泡状癌细胞株ML-1均购自中国科学院上海生科院研究所，高糖DMEM、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）及胰蛋白酶均购自美国Gibco公司，总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒均购自上海碧云天生物有限公司，miS-cript SYBR Green聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒购自德国Qiagen公司，噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂粉末、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶剂均购自美国Sigma公司，钠碘转运体（sodium iodide transporter，NIS）抗体和兔抗鼠-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）抗体均购自美国Millpore公司，放射性Na131I溶液购自中国工程物理研究院，细胞固定穿孔试剂盒购自美国BD公司，pcDNA3.1/NT-GFP-PAX8过表达质粒和pcDNA3.1/NT-GFP空载质粒均由上海吉凯生物科技有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 正常甲状腺细胞株HTori-3、甲状腺乳头状癌细胞株NPA87和甲状腺滤泡状癌细胞株ML-1充分解冻后，接种于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，于5%CO2、37℃、饱和湿度培养箱培养，根据细胞密度1～2天换液1次，3～5天传代1次。

1.2.2 实时荧光定量PCR法检测PAX 8mRNA的相对表达量 取正常甲状腺细胞株HTori-3、甲状腺乳头状癌细胞株NPA87和甲状腺滤泡状癌细胞株ML-1，依据总RNA提取、逆转录和miScript SYBR Green PCR试剂盒操作说明书完成总RNA提取、cDNA制备和PCR扩增，其中PCR扩增体系为50 μl，反应条件：94 ℃ 15 min，92 ℃ 30 s，60 ℃28s，70 ℃ 28 s，共40个循环。以β-actin为内参，以2-△△Ct计算PAX8mRNA的相对表达量。本实验重复3次。

1.2.3 转染及分组方法 取甲状腺乳头状癌细胞株NPA87和甲状腺滤泡状癌细胞株ML-1，分别转染pcDNA3.1/NT-GFP-PAX8过表达质粒和pcDNA3.1/NT-GFP空载质粒，分别作为过表达组、空载组，建立稳定转染细胞系，将未做处理的细胞作为空白对照组。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖能力 取甲状腺乳头状癌细胞株NPA87和甲状腺滤泡状癌细胞株ML-1过表达组、空载组和空白对照组对数生长期细胞，调整细胞浓度为4×105/ml，取100 μl接种于96孔板上，每组设置3个复孔，共培养5天，于第1、3、5天，分别取3孔分别加入20 μl的MTT（37℃水浴箱孵育4 h）和100 μl的DMSO（充分震荡混匀5 min），置于EXL800酶联免疫分析仪上测定各孔490 nm处的光密度（optical density，OD）值，绘制曲线获取细胞数。本实验重复3次。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞NIS蛋白的表达量取甲状腺乳头状癌细胞株NPA87和甲状腺滤泡状癌细胞株ML-1过表达组、空载组和空白对照组对数生长期细胞，调整细胞浓度为4×105/ml，取100 μl接种于96孔中，每组设置3个复孔，共培养5天，于第1、3、5天分别取3孔制备成单细胞悬液，后用细胞固定穿孔试剂盒对细胞进行固定穿孔，并加入NIS抗体，4℃反应60 min，缓冲液冲洗3次后，加入FITC标记兔抗鼠二抗，37℃水浴箱孵育30 min，缓冲液洗3次，采用流式细胞仪检测NIS荧光强度。本实验重复3次。

1.2.6 摄碘能力实验检测细胞摄碘能力 取甲状腺乳头状癌细胞株NPA87和甲状腺滤泡状癌细胞株ML-1过表达组、空载组和空白对照组对数生长期细胞，调整细胞浓度为4×105/ml，取100 μl接种于96孔板中，每组设置3个复孔，共培养5天，于第1、3、5天分别取3孔进行分析，每孔加入0.5 μCi的131I溶液500 μl，继续培养60 min；弃液，低温预冷Hank's平衡盐溶液（Hank's balanced salt solution，HBSS）洗涤3次，加入500 μl甲酸细胞裂解液20 min；吸取以上溶液至测量管中，并利用γ计数仪测量放射性活度，绘制曲线获取相对碘吸收量。本实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对所有数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多个时间点重复测量采用重复测量方差分析，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验，两组间比较t检验；PAX8与NIS蛋白的关系采用Pearson法分析；采用Image proplus软件对免疫荧光强度进行半定量分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PAX 8 mRNA相对表达量的比较

正常甲状腺细胞株HTori-3、甲状腺乳头状癌细胞株NPA87中PAX8mRNA的相对表达量均高于甲状腺滤泡状癌细胞株ML-1，正常甲状腺细胞株HTori-3中PAX8mRNA的相对表达量高于甲状腺乳头状癌细胞株NPA87，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同类型甲状腺细胞PAX 8 mRNA相对表达量的比较（±s）

表1 不同类型甲状腺细胞PAX 8 mRNA相对表达量的比较（±s）

注：a与正常甲状腺细胞株HTori-3比较，P＜0.05；b与甲状腺乳头状癌细胞株NPA87比较，P＜0.05

细胞PAX8 mRNA正常甲状腺细胞株HTori-31.53±0.09甲状腺乳头状癌细胞株NPA871.21±0.10a甲状腺滤泡状癌细胞株ML-10.69±0.08a bF值323.83P值0.000

2.2 细胞增殖活性的比较

培养第1天，NPA87细胞和ML-1细胞过表达组、空载组和空白对照组细胞数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；培养第3、5天，NPA87细胞和ML-1细胞中，过表达组细胞数均低于空载组和空白对照组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）；但空载组和空白对照组细胞数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 培养第 1、 3、 5天各组细胞数比较（×10 4，±s）

表2 培养第 1、 3、 5天各组细胞数比较（×10 4，±s）

注：a与甲状腺乳头状癌细胞株NPA87过表达组比较，P＜0.05；b与甲状腺滤泡状癌细胞株ML-1过表达组比较，P＜0.05

细胞 时间 过表达组 空载组 空白对照组甲状腺乳头状癌细胞株 第1天4.15±0.024.13±0.014.12±0.02 NPA87第3天4.38±0.025.12±0.06a5.14±0.01a第5天4.56±0.036.15±0.04a6.13±0.07a甲状腺滤泡状癌细胞株 第1天4.06±0.034.26±0.024.64±0.04 ML-1第3天4.11±0.015.87±0.03b6.86±0.04b第5天4.08±0.015.89±0.02b6.81±0.07b

2.3 NIS蛋白表达情况

在NPA87细胞和ML-1细胞中，过表达组细胞NIS蛋白荧光强度高于空载组和空白对照组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05），但空载组和空白对照组NIS蛋白荧光强度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表3、图1）

表3 各组细胞NIS蛋白荧光强度的比较（%，±s）

表3 各组细胞NIS蛋白荧光强度的比较（%，±s）

注：a与甲状腺乳头状癌细胞株NPA87过表达组比较，P＜0.05；b与甲状腺滤泡状癌细胞株ML-1过表达组比较，P＜0.05

细胞 过表达组 空载组 空白对照组甲状腺乳头状癌细胞株172.49±5.48110.38±6.22a111.55±4.62a NPA87甲状腺滤泡状癌细胞株175.36±3.64112.67±5.19b109.31±5.06b ML-1t值0.7560.4890.566P值0.4920.6500.602

图1 NPA87细胞和ML- 1细胞中各组细胞NIS蛋白表达荧光图（×400）

2.4 摄碘能力的比较

在NPA87细胞和ML-1细胞中，过表达组细胞相对碘吸收量高于空载组和空白对照组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05），但空载组和空白对照组相对碘吸收量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表 4）

表4 各组细胞相对碘吸收量比较（%，±s）

表4 各组细胞相对碘吸收量比较（%，±s）

注：a与甲状腺乳头状癌细胞株NPA87过表达组比较，P＜0.05；b与甲状腺滤泡状癌细胞株ML-1过表达组比较，P＜0.05

细胞 过表达组 空载组 空白对照组甲状腺乳头状癌细胞株159.75±7.23110.35±2.19a101.31±2.08a NPA87甲状腺滤泡状癌细胞株161.72±6.11105.74±2.52b101.34±0.58b ML-1t值0.3612.3920.024P值0.7370.0750.982

2.5 PAX 8与NIS蛋白的相关性

Pearson相关分析结果显示，PAX8与NIS蛋白呈正相关（r=0.915，P＜0.05）。

3 讨论

甲状腺癌的治疗方式主要包括手术、甲状腺激素抑制疗法、靶向治疗和放射性131I治疗，其中手术、甲状腺激素抑制疗法、靶向治疗对高分化型甲状腺癌的效果明显，预后良好，但对低分化型甲状腺癌的效果不明显，随后的研究发现，131I放射治疗是分化差甲状腺癌治疗中不可或缺的环节[7-8]。NIS基因位于人19号染色体短臂上，其编码的NIS蛋白是一种具有跨膜结构糖蛋白，主要表达于甲状腺滤泡细胞基底膜上，可通过主动转运血液中碘离子进入甲状腺滤泡上皮细胞参与碘的机体代谢，是评价细胞摄碘能力的关键指标[9-10]。NIS蛋白在正常甲状腺组织中表达水平较高，但在甲状腺瘤、甲状腺癌等相关疾病中表达异常，结果各具差异；有研究认为者与患者的基因表达相关[11-12]。

本研究以正常甲状腺细胞作为参照，选取临床较为常见两种细胞——乳头状癌细胞NPA87和滤泡状癌细胞ML-1进行研究，结果发现，PAX8基因在甲状腺乳头状癌和滤泡状癌细胞中均呈低表达，且泡状癌细胞更低，表明PAX8基因可能作为抑癌基因参与甲状腺癌的发生发展，推测PAX8基因可能会抑制肿瘤细胞增殖，且对滤泡状甲状腺癌作用更明显，国内外的相关报道较少，具有一定研究价值。为进一步探讨PAX8基因对不同类型甲状腺癌细胞的影响，本研究设计并构建了PAX8过表达质粒，可靶向提升PAX8的表达水平，同时设立质粒空载组和空白对照组，排除质粒和肿瘤细胞本身对研究的干扰，设计基本合理，效果尚好，结果发现，培养第3、5天，NPA87细胞和ML-1细胞中，过表达组细胞数均低于空载组和空白对照组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表明PAX8过表达可抑制甲状腺癌细胞增殖，验证了上述猜想。

NIS蛋白与131I放射治疗密切相关，是实施131I放射治疗的前提，提高肿瘤细胞摄碘能力意义重大，可有效改善甲状腺患者预后；基因治疗虽可达到靶向治疗的目的，但远期预后仍不清楚，联合治疗在一定程度上可延长其有效期[13]。为此，本研究就PAX8基因与甲状腺癌细胞NIS蛋白和相对碘吸收量关系进行探讨，结果发现，在NPA87细胞和ML-1细胞中，过表达组细胞NIS蛋白荧光强度和相对碘吸收量均高于空载组和空白对照组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05），但空载组和空白对照组NIS蛋白荧光强度和相对碘吸收量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；此外，Pearson相关分析结果显示，PAX8与NIS蛋白呈正相关。但NPA87细胞和ML-1细胞中，空载组和空白对照组细胞数、NIS蛋白荧光强度和相对碘吸收量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），与前面关于PAX8mRNA细胞类型的差异性相悖，这可能是因为体外研究中相互作用比较单一，关联性较差，具体原因及机制有待后续研究。

综上所述，PAX8基因在甲状腺乳头状癌和滤泡状癌细胞中均呈低表达，且后者表达水平更低；过表达PAX8可抑制甲状腺癌细胞增殖，促进NIS蛋白表达，增强摄碘能力。