肺癌患者多周期化疗中淋巴细胞亚群数量及 T细胞表面共抑制分子的动态表达研究

吴红波，穆晓倩，吴慧娟，陈利娟，刘杰，胡秀峰，赵艳秋

河南省肿瘤医院（郑州大学附属肿瘤医院）呼吸内科，郑州4500000

肺癌是恶性肿瘤中发病率和病死率最高的肿瘤，2015年中国肺癌病死率为39.81/10万，病死率高、预后较差[1]，近年来肺癌发病率和病死率均呈逐渐增高的趋势[2]。非小细胞肺癌是肺癌最常见的类型，发现时多为晚期，对出现淋巴结转移患者，5年生存率明显降低[3]。化疗是肺癌目前主要的治疗方案之一，含铂的双药化疗方案是目前的标准治疗方案，能提高晚期肺癌患者化疗客观有效率和疾病控制率，延长晚期肺癌患者的无进展生存期[4]。研究表明，化疗药物能明显影响患者机体免疫功能[5]。肺癌患者的外周血淋巴细胞，如T淋巴细胞等亚群水平对预后具有重要影响，外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+是肺癌患者预后的影响因素[6]。本研究旨在通过分析肺癌多周期化疗中外周血淋巴细胞亚群数量变化及T细胞表面共抑制分子变化，了解机体免疫状态的变化，为临床个体化的肿瘤免疫治疗提供初步的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年1月至2018年1月于河南省肿瘤医院就诊的肺癌患者的病历资料。纳入标准：①经病理学或细胞学检查确诊为肺癌，既往未行其他肿瘤治疗及影响免疫功能的药物治疗；②行为状态良好，卡氏功能状态（Karnofsky performance status，KPS）评分≥70分，生存时间大于3个月；③具有计算机断层扫描（CT）可测量的肿瘤病灶。排除标准：①合并严重心、肺、肝、肾等器官功能障碍；②伴有急性感染性疾病或免疫系统疾病；③因化疗过程中疾病进展转二线治疗，未完成5个周期化疗或失访。根据纳入、排除标准，共纳入124例肺癌患者，男性73例，女性51例；年龄37～78岁，中位年龄58岁；肺腺癌63例，鳞状细胞癌31例，小细胞肺癌30例；I期23例，Ⅱ期16例，Ⅲ期34例，Ⅳ期51例；淋巴结转移85例，无淋巴结转移39例。

1.2 化疗方法

所有患者均经连续5个周期化疗后进行疗效评价，化疗前及最后一次化疗后1个月行CT或磁共振成像（MRI）检查评价疗效，随时评价不良反应。I期、Ⅱ期和Ⅲ期的73例患者均为术后辅助化疗；Ⅳ期51例患者均予以标准化疗。化疗方案采取含铂类双药化疗，非小细胞肺癌采用吉西他滨+顺铂（GP）方案（第1、8天予吉西他滨1000 mg/m2，第1～3天予以顺铂35 mg/m2，每3周为一个周期）或长春瑞滨+顺铂（NP）方案（第1、8天予长春瑞滨25 mg/m2，第1～3天予以顺铂35 mg/m2，每3周为一个周期），小细胞肺癌采用依托泊苷+顺铂（EP）方案（第1、8天予顺铂35 mg/m2，第1～3天予以依托泊苷100 mg/m2，每3周为一个周期）。

1.3 检测指标

应用BD FACSanto流式细胞仪及流式抗体（购自美国BD公司）检测所有患者连续5个化疗周期化疗前及化疗后1个月（以排除化疗对免疫细胞的一过性杀伤作用）晨起空腹外周血T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、B 细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞水平及程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA-4）、淋巴细胞活化基因 3（lymphocyte activating gene 3，LAG-3）表达水平。检测具体操作步骤：5 ml全血加入抗凝剂抗凝，与10 μl相应抗体混匀，同型对照，室温下避光孵育20 min，加入红细胞裂解液，室温下避光5～10 min，离心5 min后弃上清，洗涤2次加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）并上机检测。采用流式细胞微球阵列术试剂盒（购自美国BD公司）检测所有患者各周期化疗后外周血白细胞介素（interleukin，IL）-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，用梯度法稀释各细胞因子的标准液，加入微球混合液和藻红蛋白荧光染液，混匀后避光3 h，加入洗液后离心弃上清，上机检测各标本细胞因子浓度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组比较采用t检验，多组比较采用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 淋巴细胞亚群数量及 T细胞表面共抑制分子水平变化趋势

124例患者在5个周期化疗过程中，外周血CD4+T细胞明显增加（F=12.347，P=0.000），CD8+T细胞、B细胞、NK细胞减少（F=5.425、4.237、3.021，P=0.000、0.002、0.012），PD-1水平明显提高（F=5.123，P=0.002）；CTLA-4、LAG-3水平无明显差异（F=1.247、0.648，P=0.279、0.574）。（表1）

2.2 细胞因子水平变化

124例肺癌患者5个周期化疗过程中，各周期化疗后外周血IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α及IFN-γ水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表 2）

2.3 淋巴细胞亚群数量及共抑制分子表达水平与肺癌临床分期、分化程度的关系

Ⅲ～Ⅳ期、低分化的肺癌患者外周血CD4+/CD8+水平分别低于I～Ⅱ期、高中分化患者，差异均有统计学意义（t=2.698、2.567，P＜0.05）；不同临床分期及分化程度的肺癌患者CD3+、CD4+、CD8+、LAG-3、CTLA-4、PD-1、B细胞、NK细胞水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

表1 124例肺癌患者各周期化疗中淋巴细胞亚群及 T细胞表面共抑制分子水平（±s）

表1 124例肺癌患者各周期化疗中淋巴细胞亚群及 T细胞表面共抑制分子水平（±s）

指标CD4+CD8+B细胞NK细胞PD-1 CTLA-4 LAG-3 36.15±10.86 25.14±7.04 10.38±3.43 14.12±8.02 11.78±5.32 2.47±1.45 2.72±1.60 41.33±11.31 23.61±7.33 10.02±4.63 13.15±7.46 12.02±4.35 2.84±1.71 2.49±1.22 44.02±12.87 22.61±6.79 9.81±2.95 12.20±8.27 14.18±5.01 2.67±1.53 2.37±1.57 51.39±12.60 21.63±6.63 8.17±2.91 11.08±7.84 15.01±6.82 2.78±1.64 2.26±1.89 54.52±10.11 19.84±6.59 7.25±2.34 9.56±5.46 17.44±8.17 2.60±1.91 2.50±1.46化疗第一周期化疗第二周期化疗第三周期化疗第四周期化疗第五周期

表2 124例肺癌患者各周期化疗后外周血细胞因子水平（pg/ml，±s）

表2 124例肺癌患者各周期化疗后外周血细胞因子水平（pg/ml，±s）

指标TNF-αIFN-γIL-2IL-4IL-6IL-10IL-17 2.83±0.80 6.91±2.64 2.10±0.41 3.10±1.12 10.78±5.32 3.87±1.45 22.02±15.60 2.76±0.92 6.87±2.71 2.12±0.53 3.15±1.06 11.02±4.65 3.64±1.55 21.38±16.62 2.79±0.75 6.86±2.57 2.13±0.45 3.20±1.26 10.11±6.10 3.90±1.63 23.27±14.57 2.81±0.83 6.90±2.63 2.08±0.36 3.08±1.37 11.21±6.12 3.78±1.64 22.26±13.89 2.77±0.93 6.89±2.31 2.23±0.64 3.19±1.64 10.56±5.89 3.90±1.81 22.50±15.46化疗第一周期化疗第二周期化疗第三周期化疗第四周期化疗第五周期

3 讨论

以铂类为主的联合化疗是肺癌重要的治疗方式之一，可以减轻患者临床症状，改善生活质量，延长生存时间，但传统化疗在肿瘤治疗中缺乏特异性，易出现各种化疗相关不良反应，为实现肿瘤个体化治疗，许多学者利用各种分子指标和免疫指标对肿瘤患者进行评估，指导临床治疗。肿瘤的发生、发展过程与机体免疫功能异常密切相关，近年来随着肿瘤免疫研究的不断深入，学者发现许多肿瘤患者体内免疫细胞数量异常及细胞表面抑制性受体表达异常，参与肿瘤的免疫逃逸等过程[8]。肿瘤免疫治疗通过调整机体免疫功能，增强机体的抗肿瘤能力，在许多肿瘤治疗中获得较好的临床疗效[9]。

以往有研究表明，肺癌组患者与健康对照组相比，CD3+T细胞、CD4+T细胞比例及CD4+/CD8+明显较低[10]，CD3分子与T细胞识别抗原形成复合物，通过结合抗原传递活化信号，是T细胞表面标记。CD4+T细胞是一种辅助性T细胞，协助机体抗肿瘤免疫反应。有研究表明，肺癌患者在多种免疫抑制因素作用下处于免疫抑制状态，抑制CD3+、CD4+的分化成熟，进而减少 CD3+、CD4+数量[11]。本研究中分析了肺癌组患者化疗前淋巴细胞亚群水平与临床分期及分化程度的关系，结果表明Ⅲ～Ⅳ期、低分化的肺癌患者外周血CD4+/CD8+水平分别低于I～Ⅱ期、高中分化患者，与以往研究一致[12]，其机制可能与高分期、低分化肿瘤负荷大，肿瘤产生较多免疫抑制因子有关。在连续5个周期化疗过程中，患者外周血CD4+T细胞明显增加，CD8+T细胞、B细胞、NK细胞明显减少，与国内研究报道一致[13]，其机制可能与肿瘤患者细胞免疫功能受到抑制，辅助识别和直接杀伤肿瘤细胞功能下降，机体处于对肿瘤的免疫耐受状态有关[14]。此外，化疗后肿瘤负荷降低，肿瘤产生的抑制免疫系统的物质减少。化疗引起的淋巴细胞水平降低能够刺激机体免疫系统，这种自稳性增生能够增强机体抗肿瘤免疫应答[15]。肿瘤微环境中的各种细胞在各种刺激、因子作用下均可产生细胞因子，如IL-10、IL-6参与肿瘤细胞发生上皮-间充质转化，促进肿瘤细胞的局部浸润和远处转移，IL-2参与巨噬细胞极化为M2型，与肿瘤细胞的免疫耐受有关。本研究中对肺癌患者多周期化疗过程中外周血细胞因子 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α及 IFN-γ进行检测，差异均无统计学意义，可能与外周血细胞因子检测特异度低有关，进一步检测肿瘤局部微环境中肿瘤细胞因子表达情况，可能有助于解释细胞之间相互作用的机制。

表3 不同临床分期及分化程度肺癌患者淋巴细胞亚群数量及共抑制分子表达水平（±s）

表3 不同临床分期及分化程度肺癌患者淋巴细胞亚群数量及共抑制分子表达水平（±s）

指标临床分期I～Ⅱ（n=39）Ⅲ～Ⅳ（n=85）分化程度高中分化（n=53）低分化（n=71）CD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+LAG-3 CTLA-4 PD-1 B细胞NK细胞69.7±11.1 36.4±11.5 25.2±7.8 1.6±0.7 2.6±1.5 2.8±1.9 13.2±3.4 12.2±2.7 17.8±3.9 65.0±9.8 37.5±10.1 28.7±5.8 1.3±0.6 2.4±2.1 2.6±2.0 11.9±5.2 10.2±2.1 15.8±4.7 66.2±12.8 37.1±9.1 26.7±8.8 1.5±0.5 2.5±2.0 2.6±1.9 13.9±6.4 11.1±3.9 16.7±4.0 64.9±12.3 35.9±10.4 24.9±5.8 1.3±0.7 2.4±2.2 2.5±1.9 11.9±6.8 11.8±3.0 15.2±3.9

本研究患者在5个周期化疗过程中，PD-1水平明显增加。PD-1位于活化T细胞表面，与肿瘤细胞表面相应配体程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）结合，激活PD-1/PD-L1信号通路，诱导肿瘤特异性T细胞凋亡，肿瘤局部形成免疫抑制性的微环境。以往研究亦证实，肿瘤微环境中的LAG-3、CTLA-4及PD-1等细胞表面共抑制分子表达水平增加，可导致杀伤肿瘤细胞功能下降，表现为穿孔素及颗粒酶分泌能力降低，T细胞免疫监视功能下降，介导肿瘤免疫逃逸[16]。化疗后T细胞表面PD-1表达上调可能与肿瘤细胞诱导T细胞表面PD-1表达，进而抑制T细胞的增殖活化有关。有研究表明，PD-1高表达时存在T细胞耗竭，T细胞功能受抑制，与患者较短的生存时间和不良预后密切相关[17]。

综上所述，研究肺癌多周期化疗中外周血淋巴细胞亚群数量变化及T细胞表面共抑制分子变化，对于了解机体免疫状态的变化，选择敏感患者予以免疫治疗具有重要意义，有待进一步研究。