循环肿瘤脱氧核糖核酸基因突变检测在非小细胞肺癌中的应用价值

季凤俊，秦恺，叶飞，陆松华

海安市人民医院胸外科，江苏 海安2266000

肺癌是常见的呼吸系统恶性肿瘤，发病率和致死率均较高，严重威胁人类的健康和生命。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的最常见类型[1]，通常部分NSCLC患者确诊时已发展至晚期，预后极差。准确获知肿瘤的生物学信息，从而在基因分型指导下进行个体化治疗对于指导NSCLC患者的临床用药至关重要[2]。目前，临床常规采用组织脱氧核糖核酸（transferred deoxyribonucleic acid，tDNA）检测基因分型，但此检测对身体的创伤性大，且对标本获取有较高的要求。循环肿瘤脱氧核糖核酸（circulating tumor DNA，ctDNA）是人体血液中的小片段游离脱氧核糖核酸（cell free DNA，cfDNA），存在于外周血、脑脊液等体液中，主要由坏死或凋亡的肿瘤细胞释放[3-4]。外周血ctDNA可被定性、定量和追踪，将有可能为临床肿瘤的早期诊断、预后预测及跟踪随访等提供方便、快捷、特异、无创或微创的分子生物学检测手段[1,5]。但外周血ctDNA是否可以替代组织tDNA成为常规基因检测手段应用于临床尚未可知。鉴于此，本研究检测NSCLC患者血浆ctDNA的突变情况，并以组织tDNA为对照，评价其诊断效能，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年5月至2018年5月海安市人民医院收治的90例NSCLC患者。纳入标准：①经病理学检查确诊为NSCLC；②患者可行肿瘤根治术；③切除的组织满足检测要求；④手术前后各个所需时间点的外周血齐全且满足检测要求。排除标准：①合并严重的心、肝、肾功能不全；②合并活动性结核及其他严重的感染性疾病；③存在精神疾病；④任何因素造成的样本污染。90例NSCLC患者中，男48例，女42例；年龄35～78岁，平均（54.4±11.3）岁；腺癌72例，鳞状细胞癌14例，神经内分泌癌2例，大细胞癌2例；肿瘤分期：Ia期36例，Ib期14例，Ⅱa期14例，Ⅱb期2例，Ⅲa期22例，Ⅳ期2例。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者及家属均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 血浆分离与DNA提取

抽取患者手术前、手术后各个所需时间段的外周血，以2000 r/min的离心速度离心15 min，分离出上层的血浆和下层的红细胞。吸取上层血浆，动作需轻柔，避免吸取到中层白细胞，若一次分离后的血浆仍见少量红细胞，需继续离心，直至澄清血浆而无红细胞残余。采用Qiagen DNA提取试剂盒提取总DNA，严格按照试剂盒说明书的步骤进行操作，提取的总DNA可继续进行ctDNA的分离或置于-80℃冰箱中备用。在外周血的采集中，若发生溶血则重新抽取外周血；外周血中提取的ctDNA经过质检，若存在浓度过低、DNA已降解等情况，需重新提取ctDNA；小片段ctDNA同样纳入统计。

1.3 ctDNA分离与测序

采用Qiagen的薄膜柱吸附试剂盒从血浆中分离出ctDNA：严格按照试剂盒说明书对ctDNA的小片段进行回收，回收纯化的ctDNA需要进行末端修复、A接头连接、继续链接捕获试剂盒特定探针接头，测序时可以特异性捕获到NSCLC的驱动基因信息。对ctDNA进行上述处理后进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，然后利用深圳华大基因检测公司的Ion Proton二代测序平台进行测序，检测基因包括表皮生长因子受体外显子（epidermal growth factor receptor exon，EGFR exon）、TP53、erb-b2 受体酪氨酸激酶 2（erb-b2 receptor tyrosine kinase 2，ERBB2）、磷脂酰肌醇 3-激酶催化亚基α（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）基因，检测内容包括各个基因突变的例数、基因突变的位点和基因突变的类型（包括点突变、插入突变或缺失突变）。测序结果经局部路线搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比对后存在点突变、插入突变或缺失突变者定义为突变阳性，比对结果一致则为突变阴性。

1.4 组织DNA提取与分析

对肿瘤石蜡组织进行脱蜡、刮片处理后，使用Qiagen DNA提取试剂盒提取组织DNA，将组织DNA经超声波处理成大小为150～200 bp的小片段。后续文库构建方法和测序过程与ctDNA处理情况相同。

1.5 统计学方法

计数资料以例数和率（%）表示，计量资料以均数±标准差（±s）表示。以tDNA突变情况为金标准，计算外周血ctDNA检测肿瘤组织的灵敏度、特异度、阳性预测值、一致性以及手术前后基因突变频率的变化情况。其中，特异度=真阴性例数（/真阴性+假阳性）例数×100%；灵敏度=真阳性例数/（真阳性+假阴性）例数×100%；阳性预测值=真阳性例数（/真阳性+假阳性）例数×100%。

2 结果

2.1 术前外周血和组织中驱动基因突变对NSCLC的诊断效能

90例NSCLC患者中，有68例患者包含1个或多个驱动基因突变。68例突变的NSCLC患者中，多数患者同时存在于tDNA和ctDNA中，少数患者仅存在于ctDNA或仅存在于tDNA中。术前NSCLC患者外周血和组织中EGFRexon、TP53、ERBB2、PIK3CA基因突变诊断NSCLC的灵敏度分别为100.00%、100.00%、83.33%和100.00%，特异度分别为96.77%、100.00%、100.00%和97.62%，阳性预测值分别为93.33%、100.00%、100.00%和75.00%，一致性分别为97.78%、100.00%、97.78%和97.78%。

2.2 术前外周血和组织中DNA总体基因突变对NSCLC诊断效能的比较

tDNA诊断结果显示，58例患者呈阳性，32例患者呈阴性。tDNA和对应的术前血浆ctDNA突变诊断的一致性为75.56%，术前血浆ctDNA突变诊断NSCLC的灵敏度为72.41%，特异度为81.25%，阳性预测值为87.50%。

2.3 手术前后NSCLC患者外周血ctDNA的突变频率的比较

68例患者术前的血浆ctDNA检测结果呈阳性，共发现存在34种突变。34种突变中，EGFRexon、TP53、ERBB2、PIK3CA的突变频率分别为42.9%（30/70）、31.4%（22/70）、14.3%（10/70）、11.4%（8/70）。对所有基因突变手术前后的总体平均突变频率进行比较发现，手术前血浆ctDNA的平均突变频率为1.24，手术后血浆ctDNA的平均突变频率为0.13。（表 1）

3 讨论

目前，肺穿刺活组织检查获取的tDNA主要用于NSCLC患者基因突变的检测，但是，NSCLC患者确诊时多已为晚期，无法进行手术治疗，从而难以获取肿瘤组织。因此，采用tDNA进行NSCLC基因检测在临床靶向治疗中的应用受到了限制。外周血ctDNA是循环肿瘤细胞、凋亡的肿瘤细胞、肿瘤细胞分泌的外分泌体等进入血液循环系统的肿瘤DNA，材料容易获得，而且对肿瘤分型无要求，具有无创性，可动态监测肿瘤进展情况，因此，外周血ctDNA检测成为了肺癌精准诊断和辅助治疗的有效方法[6-9]。

本研究的90例NSCLC患者中，有68例患者包含1个或多个驱动基因突变。68例突变患者中，多数患者同时存在于tDNA和ctDNA中，少数患者仅存在于ctDNA或仅存在于tDNA中；术前，患者外周血和组织中EGFRexon、TP53、ERBB2、PIK3CA的ctDNA总突变情况比较，tDNA与对应的术前血浆ctDNA突变诊断的一致性为75.56%，术前血浆ctDNA突变诊断NSCLC的灵敏度为72.41%，特异度为81.25%，阳性预测值为87.50%，提示tDNA和ctDNA诊断NSCLC具有较好的一致性，也说明NSCLC术前外周血ctDNA用来监测肿瘤驱动基因的突变情况具有较高的可靠性，因此，本研究继续采用此法研究手术切除肿瘤组织后的患者外周血中ctDNA的突变情况，目的是探索外周血ctDNA驱动基因的突变可否进一步应用于监测术后肿瘤的动态变化，从而为临床对术后的进一步治疗提供可靠依据。

本研究发现，在四种驱动基因的所有突变中，手术前外周血ctDNA的平均突变频率为1.24，肿瘤组织切除术后两天外周血ctDNA的平均突变频率为0.13，手术前后突变频率明显下降，说明术后外周血ctDNA驱动基因的突变情况可以有效反映术后肿瘤的动态恢复状况。徐敏等[6]亦发现外周血ctDNA诊断NSCLC患者基因突变的结果与tDNA的符合率超过91%，可替代肿瘤组织切片得知基因突变情况，与本研究结果一致。另外，本研究的21例阳性患者样本中，在20例患者的肿瘤组织和外周血ctDNA中均检测到基因突变，有1例患者仅在血浆ctDNA中检测到基因突变，这可能与肿瘤大小、检测实验环节的局限性和肿瘤潜在转移等因素有关；其中，肿瘤潜在转移的可能性最大，1例仅在血浆ctDNA中检测到的突变可能是因为原发肿瘤DNA发生了转移，因此，外周血ctDNA与组织肿瘤DNA存在某些不同的基因突变[10]。血液ctDNA的释放被认为与肿瘤细胞的自行分泌或凋亡、坏死有关，同时检测具有无创性的特点，成为了良好的预后预测分子指标。既往多项研究均发现血清ctDNA水平升高与肿瘤转移、临床分期及患者的生存情况有关，根据血清ctDNA水平可预测患者预后[11-14]。

综上所述，本研究发现外周血基因突变可用于NSCLC的诊断和术后动态监测，其中，TP53、ERBB2、PIK3CA的临床参考价值略低于EGFRexon，但也可与EGFRexon共同辅助完成对NSCLC的检测。很多NSCLC相关的基因对于疾病的诊断可能均存在一定的价值，今后还会扩展基因研究的范围，为NSCLC的诊断和治疗提供更多可靠、有效的依据。因此，靶向测序检测ctDNA可检出NSCLC患者的突变基因，同时可监测患者的手术治疗效果，具有一定的可靠性，对NSCLC患者的早期诊断和治疗具有一定的临床应用价值。