肿瘤微环境相关因子与直肠癌新辅助化疗效果及微卫星稳定状况的关系

罗长顺，刘坤，汪黎明

1四川省第二中医医院普外科，成都610031

2四川大学华西医院西藏成办分院肿瘤科，成都6100000

直肠癌是临床常见的恶性肿瘤，外科手术为其主要治疗手段，但由于直肠癌的解剖学特征较为特殊，因此，直肠癌患者的病死率和复发率均较高[1-2]。肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）是构成肿瘤微环境的主要成分，影响着肿瘤的发展与结局。CD8+、CD4+T细胞对肿瘤细胞具有较强的识别与清除作用，调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）对患者自体同源肿瘤细胞的免疫应答具有抑制作用，也是免疫治疗失败的主要原因。程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）、细胞毒性 T淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）与Treg协同作用可导致免疫逃逸[3-4]。因此，本研究对新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy，NAC）前后直肠癌患者肿瘤微环境内免疫标志物的表达情况及PD-L1于直肠癌微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）状态与微卫星稳定（microsatellite stability，MSS）状态下的表达差异性进行分析，旨在为直肠癌的临床诊疗提供借鉴，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年5月至2018年6月于四川省第二中医医院接受治疗的直肠癌患者。纳入标准：①患者于NAC后行手术；②治疗前经肠镜活检确诊为直肠腺癌；③临床资料完整；④确诊前未接受过内分泌治疗、放疗、化疗等相关治疗。排除标准：①进行过腹部手术或其他重大手术；②术前接受过放疗、化疗；③手术过程中存在肿瘤广泛转移或腹腔广泛粘连。根据纳入和排除标准，本研究共纳入90例直肠癌患者，年龄为33～79岁，平均年龄为（55.18±8.72）岁；男51例，女39例；浸润深度（根据T分期）：T3期28例，T4期62例；分化程度：低分化19例，中分化66例，高分化5例；有淋巴结转移67例，无淋巴结转移23例；肿瘤距离肛缘1～13 cm，平均（5.06±1.84）cm。90例直肠癌患者接受了放疗联合化疗的方案，放疗剂量为25～50 Gy，并于同期接受了2～4个周期的奥沙利铂+亚叶酸钙+5-氟尿嘧啶（FOLFOX4）方案化疗。

1.2 主要试剂与仪器

试剂：PD-L1（克隆号 sp142）、CD4（克隆号EP204）、CD8（克隆号C8/114B）均购自上海基因科技公司，FOXP3（克隆号236A/E7）购自美国Abcam公司，CTLA-4（克隆号sc-376016）购自美国Santa Cruz公司。仪器：HI1220型烤片机和RM2235型切片机均购自德国Leica公司，PCL-05型免疫组化防脱载玻片购自日本松浪硝子工业株式会社，3500Dx型基因分析仪购自美国ABI公司，加热振荡混合仪购自北京鼎昊源科技有限公司。

1.3 组织芯片制备

①采用组织芯片空白阵列蜡块制备仪制作受体蜡块，孔径为1.8 mm，组织阵列为9×16，大小为2.5 cm×4.0 cm；②重新对蜡块进行切片，病理阅片，标记肿瘤细胞较多的位置，对受体蜡块对应位置行空芯穿刺针穿孔，取出组织芯；③绘制组织芯片阵列图，两个孔上样于第一行内，应用组织芯片、阵列图进行定位标记，依据阵列图将组织芯片填入组织，预防穿刺偏差、掉片或脱片等；④融合，预防孔内组织芯下滑，载玻片内组织芯片倒放，烤箱内放置10 min，室温冷却，反复多次以便受体蜡块和组织芯片融合。

1.4 免疫组织化学染色方法及判定标准

采用免疫组织化学染色法检测患者治疗前的活检组织标本与治疗后的手术切除组织标本，取经石蜡包埋的切片进行脱蜡处理，灭活内源性过氧化物酶，热修复暴露抗原位点，置入孵育盒内，使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3次，每次3 min，加入山羊血清，孵育10 min，再加入一抗兔多克隆抗体，4℃下孵育过夜。PBS冲洗3次，每次5分钟，滴入二抗，室温下孵育10 min，使用PBS冲洗3次，每次3分钟，再滴入辣根酶标记的链酶卵白素，采用二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，中性树胶封片。CD4主要表达于间质TIL包膜内，CD8主要表达于间质TIL的细胞质内，PD-L1表达于间质TIL的细胞核内，同时肿瘤细胞也染色；叉头框蛋白P3（forkhead box P3，FOXP3）、CTLA-4均表达于TIL的细胞质内，同时肿瘤细胞染色。每张切片均选取5个高倍视野，每视野选取100个细胞计数，无色为0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；根据阳性细胞所占比例进行评分：＜30%为1分，≥30%为2分；两项得分相乘，0～1分为阴性，2～6分则为阳性。使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件检测图像光密度。

1.5 病理评估

由两位中级及以上职称的医师采用双盲法阅片，选取5个高倍镜视野，计算TIL的阳性细胞比例，并计算其平均值。NAC前后肿瘤病理反应的评估依据Dworak等[5]的肿瘤退缩分级（tumor regression grade，TRG），共分为TRG 0～4五个等级，TRG0代表肿瘤无消退，肿瘤内纤维化占比低于25%；TRG1代表肿瘤轻度消退，肿瘤内纤维化占比为25%～50%；TRG2代表肿瘤中度消退，肿瘤内纤维化程度高于50%；TRG3代表肿瘤重度消退，仅看到纤维组织，未看到肿瘤组织；TRG4代表肿瘤完全消退。将标本进行分级，TRG3和TRG4患者归为应答组（28例），TRG0～TRG2患者归为无应答组（62例）。

1.6 荧光多重聚合酶链反应检测MSI状况

检测2个五核苷酸重复标记物（Penta E与Penta D）和5个单核核苷酸重复标记物（MONO-27、NR-24、BAT-26、CAT-25、BAT-25），蜡块重新制作切片，取8 mm切片2张以便DNA的提取，置于乙醇内5 min，冲洗后晾干，使用刀片刮下组织至EP管内，后行NDA提取，聚合酶链反应扩增，最后行毛细管电泳分离，上机检测，分析数据。采用荧光多重聚合酶链反应检测MSI状况，结果判定标准：Penta E与Penta D具有较高的多态性和较低的MSI，用于判别正常组织和肿瘤组织是否来源于同一患者。其中，高于2个Markers片段的大小发生改变为微卫星高度不稳定（microsatellite instablehigh，MSI-H），判定是MS（I判别出现变化标准为≥3 bp）；1个Markers片段的大小出现变化为微卫星低度不稳定（microsatellite instable-low，MSI-L），无Markers片段的大小发生改变为MSS。

1.7 统计学分析

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用配对t检验和两独立样本t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 直肠癌患者NAC前后免疫标志物表达情况的比较

NAC后，直肠癌患者CD4+TIL、CD8+TIL、CTLA-4+TIL的表达水平均明显高于NAC前，PD-L1+TIL的表达水平明显低于NAC前，差异均有统计学意义（P＜0.01）。NAC前后，患者的FOXP3+TIL的表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 直肠癌患者NAC前后免疫标志物表达水平的比较（%，x±s）

2.2 直肠癌患者临床特征与病理反应的关系

应答组患者28例，无应答组患者62例。两组患者的年龄比较，差异有统计学意义（t=2.375，P＜0.05）；两组患者的组织分化程度比较，差异有统计学意义（χ2=7.620，P＜0.05）。两组患者的淋巴结转移情况、性别、距离肛缘距离、浸润深度比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

2.3 免疫标志物表达情况与肿瘤病理反应的关系

NAC前，应答组患者CD4+TIL、PD-L1+TIL的表达水平均高于无应答组，FOXP3+TIL的表达水平低于无应答组，差异均有统计学意义（t=4.068、22.647、20.021，P＜0.01）。应答组患者NAC前后CD4+TIL、PD-L1+TIL、CTLA-4+TIL的表达差值分别为（3.20±0.45）%、（2.81±0.30）%、（1.06±0.64）%，均低于无应答组的（3.89±0.41）%、（3.70±0.34）%、（3.89±0.68）%，而 CD8+TIL、FOXP3+TIL的表达差值分别（4.41±0.32）%、（5.32±0.51）%，均高于无应答组的（0.65±0.31）%、（2.58±0.53）%，差异均有统计学意义（t=7.170、11.908、18.607、52.742、22.968，P＜0.05）。（表3）

表2 不同组别直肠癌患者的临床特征

表3 不同组别直肠癌患者NAC前后相关肿瘤免疫标志物的表达水平（%，±s）

表3 不同组别直肠癌患者NAC前后相关肿瘤免疫标志物的表达水平（%，±s）

免疫标志物CD4+TIL PD-L1+TIL CD8+TIL FOXP3+TIL CTLA-4+TIL时间治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后应答组（n=28）19.70±5.28 22.90±5.71 13.24±1.05 10.43±1.07 19.98±6.73 24.39±6.37 9.17±2.09 14.49±4.07 7.22±3.19 6.16±3.15无应答组（n=62）14.79±5.31 18.68±5.22 7.50±1.14 3.80±1.19 18.96±6.21 19.61±6.50 19.73±2.41 22.31±4.18 6.89±3.20 9.78±3.61

2.4 PD-L 1与MIS的关系

90例直肠癌患者中，MSI患者40例，MSS患者50例。MSI患者中PD-L1+TIL的阳性细胞比例为（10.49±1.06）%，高于MSS患者PD-L1+TIL的阳性细胞比例（3.09±1.08）%，差异有统计学意义（t=32.566，P＜0.01）。

3 讨论

CD4+T细胞不但可通过γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）杀伤肿瘤细胞，还可通过不同路径将CD8+T细胞激活，被激活的CD8+T细胞可在肿瘤部位积聚，使细胞凋亡[6-7]。本研究结果显示，NAC后，直肠癌患者CD8+TIL与CD4+TIL的表达水平均高于NAC前，说明NAC前患者机体内的免疫能力普遍较低，而放化疗可能会升高CD8+TIL和CD4+TIL的表达水平。但是，NAC前，CD8+TIL的表达水平对于患者的疗效无明显影响，说明与之前的局部免疫应答状况相比，行NAC时放化疗对患者肿瘤免疫微环境的影响更重要[8-10]。

T细胞可激活负性信号，并通过与B7相互影响从而抑制T细胞活化，进而刺激CTLA-4的阳性表达。同时，相关研究表明CTLA-4与患者的不良预后有一定关系[11]。本研究结果显示，NAC后，患者CTLA-4+TIL的表达水平较治疗前升高，说明放化疗杀伤肿瘤细胞可使肿瘤细胞分泌抑制因子，使共刺激分子CD80/CD86或树突状细胞表层主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子的表达水平发生变化，CTLA-4亦出现变化。Treg对机体自体同源肿瘤细胞的免疫应答有抑制作用，通常被认为是导致免疫治疗失败的主要因素。目前，FOXP3被认为是Treg具有特异性的标记物[12-14]。本研究结果显示，NAC前后，患者FOXP3+TIL的表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但NAC前后FOXP3+TIL低表达者易达到应答状态。在临床中，放化疗选择性的消耗会提高部分患者抗肿瘤免疫的发生率，利于肿瘤消退，但NAC所引发的肿瘤周边Treg不良反应亦会增多。

PD-L1是存在于T淋巴细胞表层的一种抑制分子，由树突状细胞、T细胞、巨噬细胞和B细胞等表达，其表达量于激活抗原呈递细胞后升高。在正常机体中，PD-1/PD-L1信号通路对维持机体的免疫耐受具有重要作用。研究发现，PD-L1在多种肿瘤中的表达上调，在肿瘤免疫应答中发挥重要作用[15-17]。但是，本研究中，NAC后，PD-L1+TIL的表达水平明显低于NAC前（P＜0.01），说明NAC可降低PD-L1在肿瘤中的表达水平，进而通过肿瘤免疫应答提高治疗效果。PD-1/PD-L1信号通路可通过多方面对T细胞起到负性调节的作用，但PD-1不是PD-L1所介导的唯一受体，PD-L1还可导致PD-1阴性T淋巴细胞凋亡，说明T淋巴细胞内可能存在导致PD-L1免疫抑制的相关受体。本研究结果显示，MSI直肠癌患者PD-L1+TIL内的阳性细胞比例高于MSS直肠癌患者，说明直肠癌MSI状态可能导致PD-L1+TIL内的阳性细胞高表达，进而影响直肠癌患者的临床疗效。

综上所述，MSI直肠癌患者肿瘤微环境内PDL1+TIL的阳性率较高，PD-L1阻断剂可能对MSI直肠癌患者的疗效更好。但是，PD-L1+TIL表达与直肠癌患者临床疗效的关系仍需今后更进一步深入探究。