趋化因子受体 7沉默对人肾癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响

吕栋，滕志刚，周云飞，陈芙蓉

开封市中心医院1泌尿外科，2病理科，河南 开封4750000

肾细胞癌又称肾癌，是中国常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，男性患者比例多于女性，且发病率随着年龄的增长而升高。肾癌的发病隐匿且缓慢，约1/3的患者一经确诊就已处于肾癌细胞转移期[1]。在临床治疗中，由于肾癌细胞对化疗药物不敏感，因此，手术治疗是目前临床最有效的治疗方案。有研究发现，发生肾癌细胞转移的术后患者的预后差，5年生存率低，仅约9%[2-3]。随着基因工程技术的不断发展，肿瘤基因靶向治疗成为临床研究领域的焦点。趋化因子受体7（CXC chemokine re-ceptor 7，CXCR7）是近年来发现的CXC型趋化因子配体12（C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12）的新受体，在多种肿瘤的细胞系中呈高表达[4]，参与介导细胞的增殖、凋亡及侵袭等[5-6]。但是，关于CXCR7在肾癌发生、发展中作用的研究少有报道。本研究旨在探讨CXCR7对人肾癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响，为肾癌的个体化治疗寻求靶点，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

肾癌组织样本来源于医院肿瘤科，健康肾组织样本来源于肾移植科的组织活检样本。人肾癌细胞系A498、786-O、ACHN均购自美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC），RPMI-1640培养基、噻唑蓝（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）、二 甲 基 亚 砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、双抗（青霉素和链霉素）、嘌呤霉素等均购于上海生工生物股份有限公司，胎牛血清、膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）试剂盒均购自杭州四季青生物工程材料有限公司，CXCR7、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bax、cleaved-caspase-3、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2、MMP9、β-actin等一抗蛋白及蛋白抑制剂，HRP羊抗兔免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）和HRP羊抗鼠IgG二抗蛋白均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；细胞裂解液、电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）试剂均购自北京索莱宝科技有限公司，CXCR7阴性对照病毒（CXCR7-NC）、CXCR7靶向shRNA均购自上海吉玛制药技术有限公司，其他试剂及耗材均购自上海生工生物股份有限公司。二氧化碳（carbon dioxide，CO2）培养箱购自日本SANYO公司，DNM-9606酶标分析仪购自北京朗普新技术有限公司，湿转仪购自美国AB公司，FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司，凝胶成像系统购自以色列DNR公司，电泳仪购自美国BIO-RAD公司，其他仪器购自德国Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人肾癌细胞系A498、786-O、ACHN均培养于含10%（v/v）胎牛血清和双抗（100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素）的RPMI-1640培养基，CO2浓度为5%，培养于37℃恒温、恒湿的细胞培养箱中。细胞复苏后培养三代后进行后续实验。

1.2.2 CXCR 7蛋白表达分析 收集处于对数生长期的肾癌细胞1×106个，提取总蛋白，采用酶标仪于490 nm波长条件下进行蛋白定量。采用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白，采用湿转法将蛋白转至硝酸纤维素膜上，于4℃条件下依次加入封闭液孵育2 h，CXCR7一抗孵育过夜（稀释比例均为1∶1000），二抗孵育2 h（稀释比例均为1∶5000）。以βactin为内参蛋白，采用ECL试剂显色，通过凝胶成像系统分析蛋白条带。筛选CXCR7蛋白高表达的细胞系用于后续实验。

1.2.3 慢病毒转染 取处于对数生长期的CXCR7高表达的细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，每孔2 ml接种于6孔板，37℃、5%CO2条件下，待细胞生长覆盖度达到50%时进行慢病毒感染，按照试剂操作说明书步骤进行慢病毒转染操作，sh-NC组加入20 μl CXCR7阴性对照病毒（滴度为2×108TU/ml）、sh-CXCR7组加入6 μl CXCR7干扰病毒（滴度为9×108TU/ml）以及 2 μl的 polybrene（5 μg/μl），转染过夜后（约16 h）每天更换新鲜培养基。培养5 d后向培养基中加入终浓度为2 μg/ml的嘌呤霉素进行耐药细胞株的筛选；对照组加入20 μl培养基，Western blot鉴定病毒转染效果，将转染成功的细胞用于后续实验。

1.2.4 细胞生长曲线测定 取处于对数生长期的sh-NC组、sh-CXCR7组和对照组细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，每孔200 μl接种于96孔板，37 ℃、5%CO2条件下连续培养，接种当天按0天计算，每24小时检测细胞生长状态，设置5个复孔。按WST-8试剂盒说明，于待测孔加入10 μlCCK8试剂，继续培养3 h，采用酶标仪于450 nm波长下测定光密度（optical density，OD）值，以WST比色值为纵坐标，绘制细胞96 h的生长曲线。实验重复3次。

1.2.5 侵袭实验检测细胞侵袭能力 取5μg纤连蛋白，采用移液器将其均匀涂抹于Transwell小室内的PVPF聚碳酸滤膜外表面，采用同样的操作方式涂抹5 μg的matrigel于膜内侧表面。调整细胞浓度，每室分别接种2×105个sh-NC组、sh-CXCR7组和对照组细胞，设置3个复孔；37℃、5%CO2温箱中培养4 h。磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次，并去除小室内侧matrigel基质胶和细胞，用多聚甲醛进行固定；400倍显微视野下随机选取10个视野，于倒置显微镜下采用双盲计数法统计膜下表面的细胞数目平均值。实验重复3次。

1.2.6 划痕迁移实验检测细胞迁移能力 将划痕实验插件置于24孔板，取处于对数生长期的目的转染细胞及对照细胞，调整细胞个数为5×105个，37℃、5%CO2条件下培养过夜（约16 h）。小心移去划痕实验插件，用完全培养基润洗3次，加入10 μmol/L丝裂霉素，继续培养2 h，更换新鲜完全培养基，显微镜下拍照，时间点为0时，继续培养24 h后拍照分析细胞的迁移情况。实验重复3次。

1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡 取处于对数生长期的细胞，调整细胞浓度为2.5×105/ml，以每孔2.5 ml接种于6孔板，37℃、5%CO2条件下过夜培养，次日用无血清培养基诱导24 h。离心收集细胞于流式上样管，按照Annexin V-FITC试剂盒说明书向每管中依次加入150 μl Annexin V-FITC结合液，使用3 μl Annexin V-FITC和2 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液重悬细胞，室温暗室孵育15 min。加PBS至500 μl混匀过300目筛子，30 min内上机检测，Cell Quest软件检测并分析细胞凋亡情况。实验重复3次。

1.2.8 Western blot法检测蛋白表达情况 取处于对数生长期的细胞，调整细胞浓度为2.5×105/ml，每孔2.5 ml接种于6孔板，37℃、5%CO2条件下过夜培养，次日用无血清培养基诱导24 h。将细胞收集于1.5 ml离心管，Western blot法提取细胞蛋白，分析沉默CXCR7蛋白的表达对细胞Bcl-2、Bax、cleavedcaspase-3、VEGF、MMP2、MMP9蛋白表达的影响，以β-actin为内参，应用Image J图像分析软件对目的条带的表达量进行定量分析。实验重复3次。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析（one-way ANOVA），当组间比较差异有统计学意义时，进一步采用SNK-q法进行两两比较；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCR 7蛋白在肾癌中的表达情况

CXCR7蛋白在肾癌组织中的表达水平为（2.27±0.33），高于健康肾组织的（0.92±0.07），差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。Western blot检测结果显示，CXCR7蛋白在A498、786-O、ACHN细胞中均有表达，在786-O细胞中的表达水平相对较高（图2），选择其用于后续研究CXCR7蛋白对肾癌细胞的影响。

图1 CXCR 7蛋白在肾癌和健康肾组织中的表达情况

图2 CXCR 7蛋白在786-O、 A498、ACHN细胞中的表达情况

2.2 慢病毒转染对786-O肾癌细胞中CXCR 7蛋白表达的影响

sh-CXCR7组786-O细胞中CXCR7蛋白的表达水平为（0.47±0.07），对照组786-O细胞中CXCR7蛋白的表达水平为（2.25±0.17），sh-NC组786-O细胞中CXCR7蛋白的表达水平为（2.19±0.15）。sh-CXCR7组786-O细胞中CXCR7蛋白的表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；sh-NC组与对照组786-O细胞中CXCR7蛋白的表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（图3）

图3 慢病毒转染对786-O肾癌细胞中CXCR 7蛋白表达的影响

2.3 CXCR 7沉默对肾癌细胞增殖的影响

WST-8法分析结果显示，慢病毒转染沉默786-O细胞中CXCR7蛋白的表达后，sh-CXCR7组786-O细胞3～5 d时的增殖能力均低于对照组和sh-NC组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；sh-NC组786-O细胞不同时间的增殖能力与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。对照组、sh-NC组、sh-CXCR7组3～5 d时的增殖能力比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同组别786-O肾癌细胞不同时间增殖能力的比较（±s）

表1 不同组别786-O肾癌细胞不同时间增殖能力的比较（±s）

注：a与对照组比较，P＜0.05；b与sh-NC组比较，P＜0.05

组别对照组sh-NC组sh-CXCR7组F值P值0.47±0.09 0.47±0.07 0.48±0.07 0.028＞0.05 1.17±0.12 1.16±0.09 1.03±0.10 2.815＞0.05 1.52±0.19 1.50±0.17 1.13±0.12a b 9.112＜0.01 2.71±0.22 2.69±0.23 1.82±0.17a b 29.750＜0.01 2.83±0.25 2.81±0.21 1.93±0.22a b 25.561＜0.01 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d

2.4 CXCR 7沉默对肾癌细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，经过无血清培养基诱导后，sh-CXCR7组786-O细胞的凋亡率为（31.57±0.22）%，对照组786-O细胞的凋亡率为（0.25±0.03）%，sh-NC组786-O细胞的凋亡率为（0.27±0.02）%，3组比较，差异有统计学意义（F=317.533，P＜0.01）。Western blot检测结果显示，sh-CXCR7组786-O细胞中Bcl-2的表达水平低于对照组和sh-NC组，Bax、cleaved-caspase-3的表达水平均高于对照组和sh-NC组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；3组 786-O 细胞中 Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3表达水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）（表2）。

2.5 CXCR 7沉默对肾癌细胞侵袭、迁移能力的影响

Transwell小室和划痕实验结果显示，对照组、sh-NC组、sh-CXCR7组的侵袭细胞数量和划痕细胞覆盖率比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。sh-CXCR7组786-O细胞的侵袭细胞数量均少于对照组和sh-NC组，划痕细胞覆盖率均低于对照组和sh-NC组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。sh-NC组786-O细胞的侵袭细胞数量、划痕细胞覆盖率与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表3）。Western blot检测结果显示，sh-CXCR7组786-O细胞中MMP2、MMP9、VEGF的表达水平均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。sh-NC组与对照组786-O细胞中MMP2、MMP9、VEGF的表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表4）。

表2 不同组别786-O肾癌细胞中凋亡相关蛋白表达水平的比较（± s）

表2 不同组别786-O肾癌细胞中凋亡相关蛋白表达水平的比较（± s）

注：a与对照组比P＜0.05；b与sh-NC组比较，P＜0.05

cleaved-caspase-3 0.21±0.02 0.24±0.02 1.15±0.16a b 162.178＜0.01 Bcl-2 0.97±0.19 0.92±0.15 0.47±0.09a b 17.054＜0.01 Bax 0.32±0.04 0.34±0.03 1.63±0.12a b 552.386＜0.01组别对照组sh-NC组sh-CXCR7组F值P值

表3 不同组别肾癌细胞侵袭细胞数量和细胞覆盖率的比较（±s）

表3 不同组别肾癌细胞侵袭细胞数量和细胞覆盖率的比较（±s）

注：a与对照组比较，P＜0.05；b与sh-NC组比较，P＜0.05

组别对照组sh-NC组sh-CXCR7组F值P值侵袭细胞数量（个）87.63±8.67 85.29±7.73 44.32±3.23a b 61.226＜0.01细胞覆盖率（%）62.35±3.42 61.89±3.27 35.81±4.33a b 84.152＜0.01

表4 不同组别肾癌细胞中侵袭和迁移相关蛋白表达水平的比较（±s）

表4 不同组别肾癌细胞中侵袭和迁移相关蛋白表达水平的比较（±s）

注：a与对照组比较，P＜0.05；b与sh-NC组比较，P＜0.05

组别对照组sh-NC组sh-CXCR7组F值P值MMP2 2.17±0.32 2.15±0.33 0.43±0.12a b 66.309＜0.01 MMP9 2.13±0.16 2.10±0.12 0.31±0.09a b 338.742＜0.01 VEGF 0.93±0.17 0.90±0.13 0.27±0.04a b 48.133＜0.01

3 讨论

研究表明，趋化因子CXCR7在免疫细胞、血管内皮细胞及多种肿瘤中呈高表达[7]，这可能会促进局部组织的血管新生，在肿瘤的增殖和转移过程中起着至关重要的作用[8]。有研究发现，CXCR7蛋白在肺组织中呈高表达，且主要存在于肿瘤内部的新生血管和肿瘤组织，而在正常的血管组织中未见其表达水平特异性升高[9]，表明CXCR7蛋白的表达情况可能与肿瘤细胞的增殖能力有关。关于CXCR7蛋白表达所激活的信号通路，研究结果存在一定差异。在关于前列腺癌的研究中，CXCR7蛋白可能介导蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也称AKT）信号通路参与细胞调节[10]；在关于肝癌的研究中，CXCR7蛋白更有可能是通过激活细胞的促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路参与细胞功能的调节[11]；在关于结肠癌的研究中，CXCR7蛋白可能通过胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路传递细胞调节信号[12]。有研究发现，CXCR7蛋白可能通过抑制肿瘤细胞的凋亡，从而促进肿瘤血管新生，增强肿瘤细胞的增殖和迁移能力[13-15]。

本研究发现，肾癌组织中CXCR7蛋白的表达水平高于健康肾组织（P＜0.05），考虑到肿瘤细胞存在异质性，本研究对常见的肾癌细胞系A498、786-O、ACHN中CXCR7蛋白的表达情况进行进一步研究，结果发现，CXCR7蛋白在3种细胞系中均有表达，其中，在786-O细胞中的表达水平较高，因此，本研究选择786-O细胞作为研究对象，通过慢病毒转染构建CXCR7细胞系，研究CXCR7蛋白对786-O细胞增殖、侵袭、迁移的影响，结果发现，与未经慢病毒转染的对照组相比，经慢病毒转染的sh-NC组786-O细胞中蛋白的表达水平以及细胞的增殖、侵袭和迁移能力比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；WST-8细胞生长能力检测结果显示，与对照组、sh-NC组比较，sh-CXCR7组细胞的增殖能力降低（P＜0.05）；流式细胞术检测结果显示，与对照组、sh-NG组比较，下调786-O细胞中CXCR7蛋白的表达后，sh-CXCR7组细胞的凋亡率升高（P＜0.05）；Western blot检测结果显示，下调786-O细胞中CXCR7蛋白的表达后，sh-CXCR7组细胞中Bcl-2、MMP2、MMP9和VEGF蛋白的表达水平均有所降低，而促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表达水平有所升高，表明CXCR7蛋白可能是通过抑制促凋亡蛋白的表达，抑制细胞凋亡，从而调控细胞的凋亡信号通路；同时CXCR7蛋白能够促进VEGF蛋白的表达，有利于新生血管的形成，增加肿瘤组织的营养供给，促进细胞的迁移[16]。

综上所述，在肾癌组织中，CXCR7蛋白主要通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，下调促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表达，从而抑制肿瘤细胞凋亡；同时上调肾癌组织中VEGF、MMP2、MMP9的表达，促进肿瘤内部血管形成，从而增强肿瘤细胞的增殖和迁移能力。