睑板腺癌组织p21、p53蛋白表达及临床意义

马宇，周利晓#，刘意

1郑州大学第五附属医院眼科，郑州 450052

2郑州铁路职业技术学院医学技术与工程学院，郑州 451460

睑板腺癌也被称为麦氏腺癌，是眼睑恶性肿瘤之一，是一种源于睑板腺和睫毛的皮脂腺癌，好发于60岁以上人群，且女性发病率略高于男性[1]。目前，睑板腺癌的发病机制尚未被临床完全了解，可能与种族及基因有关，好发于上、下眼睑和泪阜，且以上眼睑较为常见，但睑板腺癌的临床特征不典型，误诊率较高[2]。因睑板腺癌的病变部位较为特殊，使其对放、化疗的敏感性较差，手术是睑板腺癌的主要治疗方法，临床对小病变且病变范围在眼睑内的睑板腺癌可实施局部手术切除，而出现淋巴结转移的则需实施淋巴结清扫术，但因睑板腺癌的病变部位相对隐匿，术后复发率居高不下[3]。随着医疗技术的不断发展，眼睑部肿瘤的发病机制逐渐被阐明，睑板腺癌作为其中之一，也逐渐受到关注。p21是一种细胞周期调控蛋白，也是一种新发现的抑癌基因，其在细胞中表达水平降低可抑制肿瘤细胞增殖，还可使正常细胞增生转化为异常，增加细胞癌变风险[4]。p53蛋白作为抑癌因子之一，是人体内较为重要的细胞凋亡因子之一，其在细胞、组织中缺失或突变，细胞进行恶性病变的关键步骤之一[5]。因此，本研究探讨睑板腺癌患者睑板腺癌组织p21、p53蛋白表达及临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年6月至2019年6月郑州大学第五附属医院收治的睑板腺癌患者。纳入标准：①均经病理学诊断为睑板腺癌；②临床资料完整；③入组前均未接受药物治疗、化疗、放射治疗等其他任何治疗；④年龄≥18岁。排除标准：①合并其他恶性肿瘤、心脑血管疾病、肝肾功能不全和自身免疫疾病等；②合并严重感染性疾病；③妊娠期或哺乳期妇女。依据纳入和排除标准，本研究共纳入80例睑板腺癌患者，其中男44例，女36例；年龄18～82岁，平均（57.83±15.36）岁，＞50岁43例，≤50岁37例；病变部位：上眼睑48例，下眼睑32例；分化程度：低分化35例，中分化26例，高分化19例；淋巴结转移10例，无淋巴结转移70例；局部浸润8例，无局部浸润72例；复发28例，无复发52例。取80例睑板腺癌患者的睑板腺癌组织，均为1 cm×1 cm×0.5 cm，取材时需避开坏死部位，取其中40例患者所对应的癌旁组织，需距睑板腺癌组织3～5 cm。

1.2 免疫组化法检测p21、p53蛋白的阳性表达率

取睑板腺癌组织正常睑板组织脱蜡，二甲苯、乙醇、蒸馏水冲洗，置于0.01%枸橼酸缓冲液中进行抗原修复液，冷却至室温后磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗，3%过氧化氢避光孵育10 min，PBS冲洗。山羊血封闭，滴加一抗，4℃冰箱过夜，次日取出后室温下静置30 min，PBS冲洗，滴加二抗，室温20 min，PBS冲洗。滴加链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP），室温10 min，PBS冲洗，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色染色，苏木素复染，乙醇梯度洗脱干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。全部操作完成后采用Olympus cx31显微摄像系统观察，选取5个视野清晰区域进行结果判定，5%的PBS代替一抗作为空白对照。

1.3 结果判定

p21、p53蛋白主要定位于细胞核，细胞核内出现棕黄色或褐色颗粒为阳性。由2名及以上高年资病理科医师，在显微镜下进行双盲阅片，再将有争议结果协商一致后采纳。对染色强度和阳性细胞比例进行评分[6]。染色强度评分：无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞所占比例评分：0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分。将染色强度评分与阳性细胞比例评分相乘，0～1分为阴性，2～3分为弱阳性，4～5分为中阳性，6分为强阳性。≥2分为阳性，＜2分则为阴性。

1.4 统计学方法

采取SPSS 17.0软件对所有数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spesrman相关性分析，睑板腺癌患者睑板腺癌组织p21、p53蛋白表达情况影响因素的多因素分析采用Logistic回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p21、p53蛋白的阳性表达率比较

睑板腺癌组织p21、p53蛋白阳性表达率均明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 睑板腺癌组织及癌旁组织中p21、p53蛋白阳性表达率的比较[n（%）]

2.2 睑板腺癌患者睑板腺癌组织p21、p53蛋白表达情况影响因素的单因素分析

不同性别、年龄、病变部位睑板腺癌患者睑板腺癌组织中p21、p53蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同分化程度、淋巴结转移情况、局部浸润情况和复发情况睑板腺癌患者睑板腺癌组织p21、p53蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

2.3 睑板腺癌患者睑板腺癌组织p21、p53蛋白表达情况影响因素的多因素分析

将单因素分析中差异有统计学意义的因素（分化程度、淋巴结转移情况、局部浸润情况和复发）作为自变量，睑板腺癌患者睑板腺癌组织p21、p53蛋白表达情况作为因变量纳入多因素Logistic回归分析，结果显示，淋巴结转移、局部浸润和复发是睑板腺癌患者睑板腺癌组织p21蛋白阳性表达的独立危险因素（P＜0.05）；淋巴结转移、局部浸润是睑板腺癌患者睑板腺癌组织p53蛋白阳性表达的独立危险因素（P＜0.05）。（表3、表4）

表2 睑板腺癌患者睑板腺癌组织p21、p53蛋白表达情况影响因素的单因素分析（n=80）

表3 睑板腺癌患者睑板腺癌组织p21蛋白表达情况影响因素的多因素Logistic回归分析

表4 睑板腺癌患者睑板腺癌组织p53蛋白表达情况影响因素的多因素Logistic回归分析

2.4 睑板腺癌组织中p21蛋白与p53蛋白表达的相关性分析

Spearman相关性分析结果显示，睑板腺癌组织中p21蛋白与p53蛋白表达呈正相关（r=0.413，P＜0.01）。

3 讨论

睑板腺癌主要指人体眼皮上油脂分泌结构睑板腺出现的肿瘤，其主要表现形式为麦粒肿、霰粒肿，发病率仅次于基底细胞癌，但恶性程度远超基底细胞癌，可经患者血液和淋巴系统进行转移，故病死率也较高[7]。睑板腺癌临床特点多变，易与睑板腺囊肿、基底细胞癌、磷状细胞癌等混淆，误诊率和复发率均较高[8]。随着近年对眼部疾病重视程度逐渐提升，部分学者已逐步将其研究转向睑板腺癌发病机制，并不断将其向蛋白质、基因方向转变，进一步为疾病早期诊断、复发等提供参考依据。

p21作为细胞周期依赖性激酶抑翩蛋白家族成员之一，可负性调节细胞周期G1期，主要是通过将细胞周期停留在G1阶段，阻止DNA复制。p21在受损DNA中作用机制也有一定差异，p21可在DNA损伤S期前通过与其他蛋白结合后抑制其功能，进而使细胞停滞于G1周期；当DNA损伤处于S期时，可通过让其他物质失活，抑制DNA合成，进而修复细胞[9-10]。正常细胞功能协调是通过细胞周期和DNA复制完成的，当其出现p21减少、缺失时会打破该平衡，使得DNA复制出现异常，可导致正常细胞周期功能控制出现紊乱[11]。多研究证实，p21表达缺失与肿瘤细胞迅速生长密切相关，且已在胃癌、肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中证实[12-15]，且本研究对睑板腺癌组织中p21蛋白阳性表达率进行检测，结果发现，睑板腺癌组织中p21蛋白阳性表达率高于癌旁组织。相关研究显示，p21是现阶段发现的抑癌基因之一，其在肿瘤组织中高表达可能是机体对肿瘤的一种抵抗措施[16]。姜素等[17]研究证实，p21表达水平与肿瘤分化、增生、转移有关，且对患者预后有一定预测价值，与本研究结果基本一致。本研究结果显示，淋巴结转移、局部浸润和复发是睑板腺癌患者睑板腺癌组织p21蛋白阳性表达的独立危险因素，表明p21蛋白可能参与睑板腺癌形成，其表达水平增加可能意味着睑板腺肿瘤出现恶化，且与预后间可能存在一定关系。

p53是目前人类肿瘤蛋白中发现的相关性较高蛋白之一，其基因与编码蛋白均参与细胞周期调控，并参与到细胞生长、凋亡、分裂，具有一定防止癌变和修改缺陷作用[18]。野生型p53是抑癌基因，其中突变型p53对正常p53蛋白具有一定抑制作用[19]。突变型p53是致癌基因之一，且突变后的细胞相对较稳定，可对异常细胞恶性增殖、癌变等起到一定促进作用，同时易在体内聚积[20]。卢洪胜等[21]研究结果显示，p53蛋白在胃癌中呈异常增多状态，这与本研究内容相似。本研究结果显示，睑板腺癌组织中p53蛋白阳性表达率明显高于癌旁组织，表明p53基因在睑板腺癌组织中突变率较高；本研究还将p53蛋白表达水平与患者临床病理因素间关系进行分析，发现淋巴结转移、局部浸润是睑板腺癌患者睑板腺癌组织p53蛋白阳性表达的独立危险因素，证明p53蛋白在睑板腺癌早期有一定影响。

p21基因上有2处p53结合位点，其表达水平高低可能是受上游基因p53的调控，进而调控细胞周期G1期生长限制性位点[22]。为此，本研究对两种蛋白间相关性进行研究，发现两种蛋白在睑板腺癌组织中表达呈正相关，证明p21、p53蛋白在睑板腺癌组织发生、生长、浸润、转移等过程中存在一定协同作用，在一定程度上为睑板腺癌早期诊断、预后评估等具有积极意义。

综上所述，p21、p53蛋白在睑板腺癌组织表达水平明显较高，其中p21蛋白对早期疾病和预后均存在一定影响，而p53蛋白仅对疾病早期有一定影响，且两蛋白在睑板腺癌发生、发展过程中具有协同作用。