MTDH基因和ATG7基因在结直肠癌中的表达及临床意义

张继业，赵丽宁，王胜良

三门峡市中心医院普外科，河南 三门峡 472000

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是高发的消 化系统恶性肿瘤，便血是其最常见的临床表现。近年来CRC的发病率及病死率呈现逐年递增趋势，肿瘤转移和肿瘤复发是CRC患者死亡的常见原因[1]。异黏蛋白（metadherin，MTDH）基因定位于8号染色体长臂22.5[2-3]。研究显示，MTDH基因在肝细胞癌、胃癌、CRC和乳腺癌等恶性肿瘤中异常表达，肿瘤细胞的增殖、侵袭和耐药过程中扮演重要角色[4-7]。自噬相关基因7（autophagy related7，ATG7）编码的蛋白质属于E1样泛素化连接酶可增强细胞自噬活性，当ATG7基因表达上调激活并诱导的自噬活性增强与CRC发生、发展有关[8-9]。但CRC中关于MTDH基因和ATG7基因表达研究较少，本研究探讨MTDH基因和ATG7基因在CRC中的表达及临床意义，以期为临床治疗提供依据，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 标本来源

选取三门峡市中心医院2013年7月至2018年7月的经病理科确诊后行手术切除的66例CRC患者，纳入的患者术前均未接受放、化疗等；排除非首次确诊的患者。本研究共纳入66例CRC患者，男性35例，女性31例，年龄43～84岁，平均（62.42±9.95）岁，TNM分期参照美国癌症联合委员会第八版结直肠癌分期标准[10]。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有研究对象及家属均对本研究知情同意并签署知情同意书。收集CRC患者的CRC组织和对应的癌旁正常组织（距离肿瘤病灶边缘2 cm及以上），切除组织后立即放入液氮中储存备用。

1.2 实验方法

采用美国Invitrogen公司的Trizol试剂盒按照说明书从组织中提取总RNA：液氮研磨-样本裂解-抽提-漂洗-洗脱。采用NanoDrop 2000检测提取的RNA浓度，随后采用日本Takara公司的反转录试剂盒进行逆转录获得cDNA。采用实时荧光定量核酸扩增检测系统（real-time quantitative PCR detecting system，q-PCR）联合SYBR Green I法在罗氏480仪器上检测CRC组织和癌旁组织中MTDHmRNA、ATG7mRNA的相对表达水平，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）mRNA表达水平为内参。MTDH上游引物：5'-CAGAGTTCCACCTGCTGACA-3'，下游引物：5'-TTCTCAGGCAGGAGTTTGGT-3'；ATG7上游引物：5'-AGCTTGGCTGCTACTTCTGC-3'，下游引物 ：5'-GTCCGGTCTCTGGTTGAATC-3'；GAPDH上游引物：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3'，下游引物 ：5'-GGAAGATGGTGATGGGATTT-3'。两步法q-PCR反应步骤：预变性95 ℃ 30 s；扩增95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、40个循环；溶解72℃延伸20 s/35个循环；溶解95℃5 s、60℃1 min；降温50℃30 s。实验结果重复3次，取平均值。

1.3 观察指标

比较CRC组织及癌旁组织中的MTDHmRNA、ATG7mRNA的相对表达水平，比较不同临床特征的CRC患者CRC组织/癌旁组织中MTDHmRNA和ATG7mRNA的相对表达量；CRC组织/癌旁组织中，MTDHmRNA和ATG7mRNA诊断结直肠癌的受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）分析和MTDHmRNA 与ATG7mRNA的相关性分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析；组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用ROC曲线评价MTDHmRNA与ATG7mRNA对CRC诊断价值；CRC患者相关性分析采用Pearson检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC 组织与癌旁组织中MTDHmRNA和ATG7mRNA的相对表达量的比较

CRC组织中MTDHmRNA的相对表达量为（4.57±1.31），显著高于癌旁组织的（2.36±0.98）；ATG7mRNA的相对表达量为（5.16±0.83），显著高于癌旁组织的（3.33±1.11），差异均有统计学意义（t=11.99、10.64，P＜0.01）。66例CRC患者中，63例患者CRC组织/癌旁组织的MTDHmRNA比值＞1；61例患者CRC组织/癌旁组织的ATG7mRNA比值＞1。

2.2 MTDHmRNA和ATG7mRNA表达与CRC患者临床特征的关系

不同性别、年龄CRC患者CRC组织/癌旁组织中MTDHmRNA和ATG7mRNA的表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期和有肝转移CRC患者CRC组织/癌旁组织中MTDHmRNA和ATG7mRNA的相对表达量明显高于Ⅰ～Ⅱ期和无肝转移的CRC患者，差异均有统计学意义（t=4.531、3.606、5.833、2.713，P＜0.01）。低分化程度的CRC患者中CRC组织/癌旁组织中的MTDHmRNA和ATG7mRNA相对表达量最高，差异有统计学意义（F=15.433、17.463，P＜0.01）。（表1）

2.3 CRC组织/癌旁组织中MTDHmRNA和ATG7mRNA诊断CRC 患者的价值

CRC组织/癌旁组织中MTDHmRNA和ATG7mRNA诊断CRC患者的AUC为0.934（95% CI：0.890～0.978）、0.900（95% CI：0.839～0.961），分别取MTDHmRNA=3.18和ATG7mRNA=4.01为截断值，其灵敏度分别为90.91%和89.39%，特异度分别为86.37%和84.35%。（图1）

表1 不同临床特征的CRC患者CRC组织/癌旁组织中MTDH mRNA和ATG7 mRNA表达情况（n=66）

图1 CRC组织/癌旁组织中MTDHmRNA和ATG7mRNA诊断CRC的ROC曲线

2.4 CRC组织/癌旁组织中的MTDHmRNA与ATG7mRNA 的相关性

CRC组织/癌旁组织中MTDHmRNA比值与ATG7mRNA比值呈正相关（r=0.372，P=0.002）。

3 讨论

CRC是常见的消化系统恶性肿瘤，发病率癌消化系统恶性肿瘤中居第四位，仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌[11]。本病多见于40～70岁人群，血便是CRC患者的最常见症状，CRC发病原因暂不清楚，可能与肠息肉、溃疡性结肠炎、血吸虫、高脂饮食、吸烟和遗传等多种因素有关，目前主要采取手术和放射两种方法。目前，中国CRC的发病率及病死率表现为明显升高趋势、地域上东部高西部低、城市高于农村等[12-13]。

肿瘤形成的一个重要原因是癌基因的激活和转录蛋白的表达，如MTDH基因激活诱导CRC增殖。早期MTDH基因编码的蛋白被认为是介导肿瘤细胞与肺血管内皮细胞进行黏附的单向跨膜蛋白。然而随后的研究表明MTDH基因编码的蛋白主要定位于细胞质或细胞核而非细胞膜，表明其并非单向跨膜蛋白[14]。近年来，研究显示MTDH基因在多种恶性肿瘤中通过调节信号通路促进肿瘤生长、血管新生、侵袭转移和治疗药物抵抗等作用[3,15]。MTDH的mRNA相对表达量在子宫内膜的正常组织中高于不典型增生子宫内膜和子宫内膜癌，且其相对表达量与肿瘤大小、淋巴结转移、脉管浸润、TNM分期、组织学分化程度和预后不良呈明显的正相关性[16]。本研究结果显示，CRC患者的CRC组织中MTDHmRNA和ATG7mRNA的相对表达量，均显著高于癌旁组织（P＜0.01）。TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期和有肝转移的CRC患者中，CRC组织/癌旁组织中的MTDHmRNA和ATG7mRNA的相对表达量，均显著高于Ⅰ～Ⅱ期和无肝转移的CRC患者（P＜0.01）。低分化程度的CRC患者中，CRC组织/癌旁组织中的MTDHmRNA和ATG7mRNA相对表达量最高（P＜0.01）。CRC组织/癌旁组织中MTDHmRNA和ATG7mRNA诊断结直肠癌的ROC曲线下面积分别为0.934和0.900，其灵敏度分别为90.91%和89.39，特异度分别为86.37%和84.35%，结果表明MTDH基因可能成为CRC诊断的新肿瘤标志物，在CRC的分子靶向治疗中具有重要意义。

自噬是真核细胞通过溶酶体途径降解细胞内受损的细胞器等大分子物质的生命过程，完成细胞代谢过程，可以促进细胞的生长、增殖，也能对不良刺激进行应答实现自我保护，同时也与肿瘤的发生发展密切相关，具有多重作用[17]。ATG7基因编码的蛋白是参与自噬过程的重要蛋白能结合并调控p53蛋白来调控细胞周期进展[18]。研究表明，ATG7基因与CRC、肺癌、肝癌等多种肿瘤异常增殖相关。当ATG7基因过表达时CRC的增殖能力明显增强[8]；小鼠模型中，ATG7基因缺失显著降低肺癌癌变的成瘤能力；敲除ATG7基因能够抑制肠上皮肿瘤的发生发展、促进机体的抗肿瘤反应[19]。ATG7基因介导的细胞自噬还能够促进肿瘤细胞耐药性的产生，例如肝癌细胞中ATG7基因通过促进自噬发生，增强索拉非等化疗药物的耐药性[20-21]。MTDHmRNA比值与ATG7mRNA比值呈正相关，表明在CRC中MTDH的过度活化促进了自噬的发生，MTDH有望成为CRC诊断和治疗的新的靶标分子，但具体的机制还需要进一步研究。

综上所述，MTDHmRNA和ATG7mRNA在CRC中表达增高，此次研究为MTDH和ATG7在CRC中的意义提供了新的见解，提示可以成为发现CRC的较好指标。