结直肠腺癌组织中MMP2、ADAM17及E-cadherin 的表达及临床意义

张敏，冯怡锟，张岩，付文静，常佳，任景丽

郑州大学第二附属医院病理科，郑州 450000

结直肠腺癌是常见的消化道恶性肿瘤，居恶性肿瘤死亡原因的第二位，且近年来其发病率呈明显上升趋势，严重危害人类生命健康[1]。尽管以手术为主，结合放射治疗、化学治疗和生物治疗等的综合治疗在临床取得了一定进展，但结直肠腺癌的5年生存率仍为50%～60%，伴远处转移的结直肠腺癌患者预后更差[2]。侵袭和转移仍然是导致患者预后不良的关键性因素，其转移的潜在性通常难以预测。结直肠腺癌的侵袭和转移是一个包括肿瘤细胞黏附、运动、基质降解和新生血管生成等多方面的复杂过程[3]。近年的研究表明，多种生物学指标与结直肠腺癌的发生、发展、复发、转移及预后密切相关[4]。基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）是基质金属蛋白酶家族成员之一，能够降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和基膜（basement membrane，BM），促进肿瘤细胞向周围组织扩散，从而对肿瘤的侵袭和转移产生影响[5]。ADAM金属肽酶域17（ADAM metallopeptidase domain 17，ADAM17）是ADAM蛋白家族的成员之一，又名肿瘤坏死因子-α转化酶（tu-mor necrosis factor-alphaconverting enzyme，TACE），已发现在多种肿瘤中均有高表达，对肿瘤的发生、发展有重要作用[6]。E钙黏蛋白（E-cadherin）作为重要的黏附分子，其低表达对于肿瘤发展具有重要作用[7]。本研究采用免疫组织化学染色技术，检测结直肠腺癌组织中MMP2、ADAM17及E-cadherin的表达情况，并与腺瘤及正常结直肠黏膜组织进行对比，探讨其在结直肠腺癌发生及发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年7月至2018年10月郑州大学第二附属医院确诊的结直肠腺癌患者的病历资料。所有患者均有详细的临床资料和手术记录，且术前均未进行放、化疗，所有标本均经苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色筛选。共纳入120例结直肠腺癌患者作为结直肠腺癌组，其中男66例，女54例；年龄37～77岁，平均（60.33±12.14）岁；肿瘤直径：＜3 cm 56例，≥3 cm 64例；分化程度：高分化26例，中分化67例，低分化27例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期78例，Ⅲ～Ⅳ期42例；有淋巴结转移50例，无淋巴结转移70例；有浆膜浸润58例，无浆膜浸润62例。从中选取30例患者作为正常结直肠黏膜组，其中男19例，女11例；年龄40～77岁，平均（59.41±11.63）岁。另取56例行同期手术切除和纤维结肠镜活检的结直肠腺瘤患者作为结直肠腺瘤组，其中男 31例，女 25例；年龄 39～75岁，平均（58.17±10.48）岁。3组研究对象性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。分别取结直肠腺癌组、正常结直肠黏膜组[结直肠腺癌标本阴性残端处（据肿瘤边缘大于15 cm，且无坏死）相对正常的结直肠黏膜（病理证实）]、结直肠腺瘤组患者的相应组织标本。

1.2 实验试剂

兔抗人MMP2、ADAM17及E-cadherin多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，PⅤ-9000二抗试剂盒、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色液均购自北京中杉金桥公司。

1.3 免疫组织化学法检测MMP2、ADAM17及E-cadherin 蛋白表达情况

参照PⅤ-9000试剂盒说明书对组织蜡块进行常规脱蜡、水化、枸橼酸盐抗原热修复，滴加内源性过氧化物酶阻断剂，滴加一抗，4℃过夜；采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次，每次2 min，滴加MMP2、ADAM17及E-cadherin一抗。在4℃下孵育过夜。用PBS冲洗3遍，每次2 min，加入二抗，在室温下孵育20 min，PBS冲洗，滴加DAB显色。苏木精复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。用已知的结直肠腺癌阳性组织切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判定

由两名受过专业培训的临床病理科医师独立阅片，MMP2、ADAM17阳性表达为肿瘤细胞质黄棕色着色，E-cadherin阳性表达为细胞膜/细胞质黄棕色着色。于高倍镜（400倍）下随机选取10个视野，依据以下准则判定阳性表达。①染色程度：0分，无色；1分，浅黄色；2分，黄色；3分，棕黄色。②阳性细胞所占百分比：0分，＜5%；1分，5%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，76%～100%。阳性强度为两种计分方式评分之和：0分为阴性（-），1～2分为弱阳性（+），3～5分为阳性（++），6～7分为强阳性（+++）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中MMP2、ADAM17及cadherin阳性表达情况的比较

结直肠腺癌组织中MMP2、ADAM17阳性表达率均高于结直肠腺瘤组织和正常结直肠黏膜组织，E-cadherin阳性表达率低于结直肠腺瘤组织及正常结直肠黏膜组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同组织中MMP2、ADAM17及E-cadherin阳性表达情况的比较[n（%）]

2.2 不同临床特征的结直肠腺癌患者的结直肠腺癌组织中MMP2、ADAM17及cadherin阳性表达情况的比较

不同肿瘤直径、分化程度、TNM分期及有无淋巴结转移、浆膜浸润结直肠腺癌患者的结直肠腺癌组织中MMP2阳性表达率比较，差异均有统计学 意 义（χ2=5.27、19.71、13.43、13.17、5.93，P＜0.05）。不同肿瘤直径、分化程度、TNM分期及有无淋巴结转移、浆膜浸润结直肠腺癌患者的结直肠腺癌组织中ADAM17阳性表达率比较，差异均有统计学意义（χ2=10.51、17.11、11.66、13.38、8.50，P＜0.05）。不同肿瘤直径、分化程度、TNM分期及有无淋巴结转移、浆膜浸润结直肠腺癌患者的结直肠腺癌组织中E-cadherin阳性表达率比较，差异均有统计学意义（χ2=4.42、2.41、8.48、6.59、7.05，P＜0.05）。不同年龄、性别的结直肠腺癌患者的结直肠腺癌组织中MMP2、ADAM17、E-cadherin阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 不同临床特征的结直肠腺癌患者的结直肠腺癌组织中MMP2、ADAM17及E-cadherin的阳性表达情况（n=120）

3 讨论

侵袭和转移是肿瘤最本质的特征之一，也是导致肿瘤患者死亡的主要原因之一，它是一个多环节、多步骤的肿瘤细胞与宿主细胞相互作用的连续过程，包括肿瘤细胞从原发灶脱离、侵犯周围组织、进入循环系统、逃避免疫监视、血管形成以及在远隔器官形成转移灶等[8]。MMP是降解细胞外基质的主要家族之一，而MMP2是MMP家族中分布最广的成员，属于明胶酶类，可作用于Ⅳ型胶原。既往研究显示MMP2在多种肿瘤组织中表达量显著高于相应正常黏膜组织，提示MMP2与肿瘤的发生发展相关，并指出了为肿瘤干预治疗而对MMP2进行相关研究的重要性[9]。在本研究中，MMP2在结直肠腺癌组织中的阳性表达率均高于直肠腺瘤组织及正常结直肠黏膜组织；而对于结直肠腺癌患者，肿瘤直径越大、组织分化程度越低、TNM分期越高、有淋巴结转移及浆膜浸润者MMP2阳性表达率越高，说明MMP2与结直肠腺癌的恶性程度有关，可以降解ECM和BM，从而促进肿瘤转移。高双英等[10]研究显示，当细胞恶变时常伴随着MMP2表达的增高，在部分肿瘤中还发现随着肿瘤恶性程度的增高，MMP2的表达也增高，且与肿瘤的浸润和转移相关，与本研究结果一致。

ADAM17是ADAM家族成员之一，最初被认为是TNF释放酶而被发现，其功能多样，在乳腺癌、胃癌、前列腺癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤中均有表达[11]。本研究发现，相比较于结直肠腺瘤组织及正常结直肠黏膜组织，结直肠腺癌组织中ADAM17阳性表达率升高，对ADAM17表达与结直肠腺癌临床特征的分析显示ADAM17高阳性表达率与肿瘤直径、分化程度、TNM分期、淋巴结转移及浆膜浸润有关，提示ADAM17的表达与结直肠腺癌的发生、发展及转移有关。此结果与乳腺癌的研究结果类似，ADAM17抑制剂通过抑制表皮生长因子受体配体的释放，减少表皮生长因子反应性乳腺癌细胞的生长速率及转移持续性[12]。有关ADAM17参与肿瘤侵袭及转移的机制尚未明确，由于肿瘤的发生、发展是多基因、多步骤的相互作用过程，包括恶性肿瘤从原发灶脱离、穿过ECM和BM，穿过血管壁进入宿主微环境等步骤[13]。ADAM17可能在肿瘤发生发展的多个环节通过参与不同调节途径发挥了作用。相关研究证实ADAM17能通过调节细胞使其黏附于相邻细胞及ECM，这可能是肿瘤细胞增殖、侵袭及转移的起始步骤[14]。ECM和BM的降解是肿瘤转移的必要步骤，ECM的降解需要专一的蛋白水解酶的作用，而ADAM17被证明是这一蛋白水解酶的类似物，其高表达能产生类似的降解作用，从而破坏ECM屏障促使肿瘤细胞发生转移[15]。

E-cadherin是一类介导同型细胞相互黏附的跨膜糖基质蛋白质，在机体的胚胎组织、成熟组织的上皮细胞和增生活跃的上皮细胞中高表达，其自身除了可以调节胚胎组织的发育、上皮组织的形成、细胞间物质和信息的传递交流外，还对促进细胞间黏附、保持上皮形态和结构功能的完整性有重要价值[16]。研究显示，E-cadherin表达下调或出现功能改变时，会导致肿瘤细胞间的黏附性下降，从而脱离原病灶，并具有发生侵袭的可能，此时肿瘤细胞易于从原病灶脱落分离，向淋巴结或远处转移[17]。本研究结果显示，E-cadherin表达与肿瘤直径、分化程度、TNM分期、淋巴结转移及浆膜浸润有关，提示E-cadherin与结直肠腺癌的发生发展及转移有关。结直肠腺癌在发展过程中，伴随着紧密连接的破坏、黏附力的下降，引起肿瘤细胞侵袭能力的增加，使肿瘤细胞脱离原发灶，容易通过淋巴管或血管发生远处转移。而当细胞黏附缺失使组织结构的完整性受到破坏后，可使细胞间变得松散，肿瘤细胞易脱落，导致肿瘤细胞扩散转移。

目前肿瘤的治疗越来越倾向于个体化，而个体化的治疗依赖于准确的术前诊断和评估。本研究证明MMP2、ADAM17随结直肠腺癌癌变程度、浸润程度加深及淋巴结转移的出现，阳性表达率升高；E-cadherin随结直肠腺癌癌变程度、浸润程度加深及淋巴结转移的出现，阳性表达率降低。这提示MMP2、ADAM17过表达及E-cadherin缺失可能引起肿瘤侵袭转移能力增强。因此，综合分析上述3项指标，可为结直肠腺癌患者临床诊断、预后判断及个体化治疗提高理论依据，具有临床应用价值。