乳腺结构紊乱中PAK4的表达及其与影像诊断的相关性

毕研青 郝敏 周海霞 刘效方 王东关

东营市人民医院乳腺甲状腺外科，山东东营257091

乳腺结构紊乱中PAK4的表达及其与影像诊断的相关性

毕研青 郝敏#周海霞 刘效方 王东关

东营市人民医院乳腺甲状腺外科，山东东营257091

目的观察乳腺结构紊乱组织中P21活化蛋白激酶4（P21 activated protein kinases 4，PAK4）的表达及其与影像诊断的相关性，探讨对乳腺结构紊乱患者手术治疗的指导价值。方法回顾性分析了2012年1月至2013年10月150例接受手术治疗的女性乳腺疾病患者资料。采用HE染色和PAK4免疫组化染色重新检测患者的组织标本。结果乳腺非增生性病变组（n=50）、乳腺增生症组（n=50）、乳腺癌组（n=50）中的PAK4表达阳性率依次升高，且三组两两比较的PAK4表达差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。在乳腺癌组中，PAK4表达与钼靶X线和超声的早期诊断结果呈正相关性（均P＜0.05）。结论PAK4表达不但在乳腺非增生性病变、乳腺增生症病变和乳腺癌中依次升高，且与乳腺癌术前影像学诊断结果呈正相关，或可用于指导乳腺结构紊乱疾病的手术治疗。

乳腺结构紊乱；乳腺癌；手术治疗；影像学；分子生物学；PAK4

Oncol Prog,2015,13(3)

乳腺良性疾病（benign breast disease，BBD）已被证实有演变为恶性肿瘤的风险，乳腺结构紊乱是乳腺疾病常见的一种影像学改变，也是乳腺癌演变过程的一个阶段。随着影像学的发展，更多的检测手段被用于乳腺疾病的检查，因此，更多的良性病变被检测出，这提高了评估某些结构特殊型乳腺癌发病风险的准确性，对临床手术治疗具有重要的指导意义。乳房穿刺活检发现乳腺癌及乳腺增生伴不典型增生毫无疑问是手术指征；但对乳腺增生不伴非典型增生的病变，若影像学提示为结构紊乱的BBD，则并非明确的手术指征。现代分子生物学证实，在真核细胞的信号转导过程中，通路蛋白磷酸化/去磷酸化修饰间的平衡在细胞正常信号转导及肿瘤发生、发展过程中起着非常重要的作用，PAK4在此途径中扮演着关键的角色。用免疫组化方法检测PAK4表达水平的变化，对判断从乳腺增生到恶变这一过程中的危险因素，对乳腺癌的早期诊断及手术指征的评估等均具有重要的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年1月至2013年10月在东营市人民医院乳腺科住院手术的150例女性乳腺疾病患者标本。其中，非增生性病变患者50例，包括囊肿20例、纤维腺瘤30例；乳腺增生患者50例，包括普通型导管增生（也称为普通型中度或重度增生）30例，导管内乳头状瘤病20例；乳腺癌患者50例（均为浸润性导管癌）。根据病变类型将患者分为三组，其中非增生病变为A组，患者年龄为18～55岁；乳腺增生病变为B组，患者年龄为18～56岁；乳腺癌为C组，患者年龄为29～75岁。术前B超、钼靶X线检查提示乳腺结构明显紊乱；术后由本院病理科制取乳腺标本蜡块，其中部分患者接受乳腺穿刺活检术取样。

1.2 研究方法

每个标本蜡块被切片2份，每份2张，分别进行HE常规染色和PAK4免疫组化染色。免疫组化染色步骤：标本脱蜡入水（PBS洗2～3次，每次5min），3%H2O2室温孵育30m in（封闭内源性过氧化物酶），蒸馏水洗3次，每次5 m in，浸入PBS中5 min；PBS洗3次，每次5 m in，滴加血清封闭液，置于室温下20 m in，倾去血清，直接滴加一抗，37℃孵育l～2 h；PBS洗3次，每次5m in，滴加生物素标记的羊抗兔IgG抗体（二抗），37℃孵育10～30 min；PBS洗3次，每次5 m in，滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10～30 m in；PBS洗3次，每次5 m in，DAB-H2O2显色5～10m in，随时镜检（DAB用时新配）。自来水冲洗10m in，苏木精复染2m in，盐酸酒精分化，氨水处理；自来水冲洗10～15 m in，脱水、透明、封片。光镜下（100倍）观察乳腺标本的结构及免疫组化染色情况。

免疫组化染色HE染色由本院病理科配制，免疫组化染色PAK4抗体（ab62509）购自Abcam生物技术有限公司。

1.3 染色及影像学判定标准

PAK4主要在乳腺腺体细胞的胞质和（或）胞核中表达，阳性细胞被染成棕黄色或深棕色，采用一抗来源的同品系动物兔的正常IgG作为阴性对照，以此判断PAK4免疫染色的特异度。结果判断参照Campo等[1-2]的标准，结合染色强度和细胞染色百分比进行评分。

1.3.1 免疫组化结果判断标准 着色弱为1分，着色中度为2分，着色强为3分，基本不着色为0分；着色细胞占总细胞数的5%～25%为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分，＜5%为0分。

1.3.2 免疫组化结果评分标准 最后以阳性细胞的百分比和染色强度记分之和所得的总分进行结果判定。0分为阴性，记为（－）；1分、2分为弱阳性，记为（＋）；3分、4分为中等阳性，记为（＋＋）；≥5分为强阳性，记为（＋＋＋）。

1.3.3 抗体阳性判断标准 PAK4免疫组化染色累计评分≥3分（中等阳性，强阳性）者为阳性，＜3分（阴性，弱阳性）者为阴性。免疫组化检测结果由两位病理学家在相同的判断标准下双盲判定，相同判定结果直接纳入统计，有差异的结果经第三位病理学家盲法判定后取三位病理学家判定结果的平均值纳入统计。

1.3.4 钼靶X线阳性判断标准 钼靶X线结果提示为簇状、泥沙样钙化或者毛刺样征，边缘模糊的结节影，美国放射学会乳腺影像报告和数据系统（BI-RADS）分级为Ⅳ～Ⅴ级者被判定为阳性结果。

1.3.5 彩超阳性判断标准 彩超提示肿块形态不规则，边界不清，呈毛刺状或蟹足状，内部回声不均匀；肿块内见微小钙化灶，肿块后方回声衰减、肿块纵横比＞1；肿块内血流信号Ⅱ～Ⅲ级，阻力指数＞0.7，提示占位性病变者被判定为阳性结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，两个或多个构成比的比较采用χ2检验，等级资料相关性采用Spearman相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 PAK4在各组研究中的表达情况

PAK4在正常乳腺组织中是不着色的。本研究中，乳腺非增生性病变组（A组）、乳腺增生病变组（B组）、乳腺癌组（C组）中的PAK4表达阳性率依次升高，且差异有统计学意义；A、B、C三组中的PAK4表达情况两两比较，差异均具有统计学意义（表1，图1～4）。

表1 三组研究对象PAK4表达情况的比较（例）

2.2 乳腺癌患者影像学特征及PAK4表达情况

50例乳腺癌组（C组）中，术前钼靶X线判定为阳性表达者有39例（78%），PAK4染色阳性者也为39例；PAK4表达与钼靶X线阳性结果呈正相关性（表2）。

50例乳腺癌组（C组）中，术前彩超判定为阳性者有41例（82%），PAK4染色阳性者为39例；PAK4表达与彩超阳性结果呈正相关性（表2）。

3 讨论

据流行病学研究结果显示，乳腺不典型增生发展成为乳腺癌的危险性显著增加[3]。乳腺增生包括、乳腺小叶增生症、纤维化增生症、乳腺癌（部分乳腺癌为乳腺增生病恶变所致）。乳腺增生与乳腺癌的关系是患者最关心的问题，也是众多学者争论和研究的焦点。众多研究[4-6]均已表明：相对于非增生性乳腺良性疾病，乳腺增生不伴非典型增生者的乳腺癌发病风险可小幅增加，而乳腺增生伴非典型增生患者的乳腺癌发病率明显升高。

表2 影像学特征及PAK4在50例乳腺癌中的表达情况

影像学检查为早期发现、早期诊断乳腺癌的主要方法。乳腺钼靶X线摄影具有较好的病变凸显性能、价格低、简单实用性的特点，因而被作为无症状女性乳腺癌筛查的首选。超声检查无射线损伤，尤其适合妊娠、哺乳期妇女检查及乳腺疾病的普查和随访。两者结合被称为检查乳腺癌的“黄金组合”[7-8]。PAK家族是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，最早发现时被作为Rho GTP酶Cdc42和Racl的特异性结合物[9]，PAK4参与Cdc42Hs与肌动蛋白细胞骨架的相互作用[10]，PAK4能在多种肿瘤细胞中高表达[11-13]。一些研究表明，PAK4在上皮细胞转化过程中也发挥关键作用[14-16]。乳腺癌是被广泛研究的上皮细胞癌症转化的典型疾病。大量研究显示，PAK4不但在乳腺癌组织中的表达远高于在其他肿瘤中的表达[17-19]，而且PAK4表达与乳腺癌细胞的增殖和侵袭转移呈正相关[20-21]。

PAK4在正常乳腺组织中是不表达的。在本研究中（图1～4），乳腺非增生性病变、乳腺增生病变和乳腺癌中的PAK4表达阳性率依次升高。对乳腺非增生性病变组、乳腺增生病变组和乳腺癌组病变中PAK4的表达进行两两比较，发现差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。

对50例乳腺癌患者术前彩超及钼靶X线诊断与PAK4表达情况进行了相关性研究，发现PAK4染色结果与两种影像学检查的乳腺癌早期诊断呈正相关。鉴于乳腺增生不伴非典型增生且影像学提示存在明显结构紊乱的BBD尚缺乏明确的手术指征，笔者认为：结合患者临床病史、查体及影像学检查，针对部分乳腺增生合并结构紊乱的患者，乳腺组织穿刺联合PAK4检测可以判断乳腺从增生疾病到恶变这一过程中的危险因素，为手术治疗提供重要的参考依据。后续研究将着重于乳腺良性疾病向乳腺癌发展过程中PAK4的具体变化，以期进一步明确PAK4在乳腺增生合并影像学结构紊乱疾病手术治疗中的价值。

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Theexpression of PAK4 in structuraldisorderofmammary gland and its correlation w ith diagnostic imaging

BIYan-qing HAOM in#ZHOU Hai-xia LIU Xiao-fang WANG Dong-guan

Departmentof Thyroid and BreastSurgery,the People's Hospitalof Dongying,Dongying 257091,Shandong China

ObjectiveTo observe the PAK4(P21 activated protein kinases 4)expression in structural disorder of mammary gland,and to investigate the correlation between PAK4 and diagnostic imaging to guide surgery.Method150 female patients w ith breast disease who had surgeries during 2012 to 2013 were retrospectively analyzed.HE staining and PAK4 immunohistochemical staining were used to investigate the structure ofmammary gland in the paraffin-embedded samples.ResultThe incidence of positive PAK4 expression increased in non-hyperplasia group(n= 50),hyperplasia group(n=50)and the breast cancer group(n=50),and the differences between groups were significant(all P<0.05).PAK4 expression in breast cancer group was positively correlated w ith early diagnostic results of mammography and ultrasonography.ConclusionThe PAK4 expression increased in non-hyperplasia/hyperplasia of mammary gland,and breast cancer,besides,the PAK 4 expression was positively correlated w ith preoperative imaging diagnosis results,and m ight be an indicator for breast surgeries for structural disorder ofmammary gland disease.

structural disorder ofmammary gland;breast cancer;surgical treatment;molecular biology;PAK4

R737.9

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.03.13

#通信作者（corresponding author），e-mail：haom in166@163.com

2014-11-06）