巨噬细胞抑制因子-1及其联合多种标志物在肺癌早期诊断和诊断中的临床意义△

张超 田海梅 李茉 王腾 李艳芬 刘静 杨塔娜 王小兵 赵文雅 沈迪 齐军 张伟#

北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院1生物检测中心，3检验科，北京100021

2首都医科大学附属北京儿童医院检验中心，北京100045

巨噬细胞抑制因子-1及其联合多种标志物在肺癌早期诊断和诊断中的临床意义△

张超1田海梅1李茉1王腾1李艳芬1刘静1杨塔娜2王小兵1赵文雅1沈迪3齐军3张伟1#

北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院1生物检测中心，3检验科，北京100021

2首都医科大学附属北京儿童医院检验中心，北京100045

目的研究巨噬细胞抑制因子-1（macrophage inhibitory cytokine-1，M IC-1）在早期肺癌诊断中的辅助价值，并评价多种肿瘤标志物联合应用的临床意义。方法应用M IC-1定量检测试剂盒及Roche Cobas 601电化学发光免疫分析仪分别检测663例未经治疗的不同临床分期的肺癌患者和488例正常人群血清样本中的M IC-1、CEA、CA125、NSE、SCC和CYFRA21-1水平和分布，分析患者血清M IC-1水平与肺癌临床分期、病理分型和细胞分化程度的关系，并研究多种标志物联合检测的价值。结果肺癌患者血清M IC-1水平显著高于正常人群（P＜0.001）；M IC-1水平随临床分期的进展呈上升的趋势（P＜0.001），且与肿瘤浸润（P＜0.001）、淋巴结转移（P=0.02）、远端转移（P＜0.001）和肿瘤分化程度（P＜0.001）显著相关。单一检测M IC-1诊断肺癌的敏感度（76.6%）高于其他五种肺癌标志物的联合应用（72.2%），且M IC-1在鳞癌、腺癌、小细胞癌诊断中的敏感度均能达到甚至超过其他五种标志物的联合诊断水平（81.6%vs 82.8%；74.7%vs 68.9%；84.9%vs 83.0%）。在肺癌早期，以M IC-1为主的六种肿瘤标志物联合检测的诊断敏感度（Ⅰ期：79.8%；Ⅱ期：87.7%）显著高于其他五种肿瘤标志物联合诊断的敏感度（Ⅰ期：44.9%；Ⅱ期：72.6%）。结论M IC-1是肺癌，尤其是早期肺癌有价值的血清肿瘤标志物，M IC-1和CEA、CA125、NSE、SCC、CYFRA21-1联合检测用于普通人群体检和肺癌早期诊断具有重要的临床意义和价值。

肺癌；巨噬细胞抑制因子-1；联合检测；早期诊断

Oncol Prog,2015,13(3)

肺癌是严重威胁我国人民健康的常见恶性肿瘤之一，其近二十年的发病率和死亡率都明显升高。20世纪70年代、90年代和21世纪初开展的三次死因调查[1-2]结果显示：中国肺癌患者的死亡率分别为5.46/10万（居癌症死因第5位）、17.54/10万（居癌症死因第3位）和30.84/10万（居癌症死因首位）；2012年，国家癌症中心收集了全国104个癌症登记处提交的2009年肿瘤登记情况的报告，对其中符合标准的72个登记处的数据分析显示，肺癌的发病率和死亡率均居首位[3]。肺癌是预后最差的恶性肿瘤之一，许多患者到医院就诊时已是局部晚期或者晚期，患者的5年生存率低于15%[4-5]。而临床研究表明，Ⅰ期患者的5年生存率高达60%～90%[6]，因此，肺癌早期诊断是提高患者生存率和治愈率的关键。

肿瘤标志物是指特征性地存在于恶性肿瘤细胞内或由恶性肿瘤细胞所产生的物质，或是宿主为对抗肿瘤而产生的物质的总称。临床常以癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖链抗原（carbohydrate antigen 125，CA125）、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、鳞状细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC）和细胞角质素片段抗原21-l（cytokeratin fragmentantigen 21-1，CYFRA21-1）五种肿瘤标志物为诊断肺癌常用的辅助指标，但它们的敏感度普遍较低。M IC-1是人转化生长因子-b（transform ing grow th factor-b，TGF-b）超家族中的一个重要分支。有研究初步表明：M IC-1表达水平在多种上皮来源肿瘤患者血清中均有显著提高，联合其他标志物可提高其诊断敏感度[7]。

本研究应用自主研发的M IC-1血清检测试剂盒对肺癌患者进行大样本系统研究，分析M IC-1在肺癌不同临床分期的表达水平差异及其分布情况，探究其与CEA、CA125、NSE、SCC和CYFRA21-1五种标志物之间的关系，并探讨M IC-1和其他肿瘤标志物联合检测在早期诊断中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 病例资料

所有病例均来自2013年7月至2014年6月中国医学科学院肿瘤医院门诊及住院的肺癌患者，所有患者均经组织病理学确诊，且采血前未接受过任何治疗。肺癌患者共663例，平均年龄为60岁。其中男性患者有426例，平均年龄为61岁；女性患者有237例，平均年龄为59岁（P=0.095）。肺癌患者中，Ⅰ期198例，Ⅱ期146例，Ⅲ期168例，Ⅳ期151例；鳞癌163例，腺癌344例，小细胞癌53例，其他类型（包括大细胞癌、肉瘤样癌、类癌、腺鳞癌、未明确病理的非小细胞肺癌等）103例。正常人群血样来自中国医学科学院肿瘤医院健康体检人群，入选标准为体格检查、血清学肝肾功能检查及影像学结果均为阴性者，共488例，平均年龄为47岁。其中男性有266例，平均年龄为47岁；女性有222例，平均年龄为47岁（P=0.916）。

1.2 样本采集和检测

1.2.1 血清样品的采集 用带有惰性分离胶的进

口真空采血管分别抽取患者空腹静脉血4m l；自然凝集30min后，于8℃下以4000 r/m in的速度离心15min后分离血清；分装并于－80℃低温冰箱保存待测。

1.2.2 血清CEA、CA125、NSE、SCC、CYFRA21-1和MIC-1水平检测方法均采用Cobas 601（购自罗氏公司）电化学发光免疫分析仪及各指标检测试剂盒检测患者的血清CEA、CA125、NSE、SCC、CYFRA21-1水平，操作严格按照说明书进行。CEA、CA125、NSE、SCC和CYFRA21-1的临界参考值分别为5 mg/L、35 000 U/L、18 mg/L、1.5mg/L和3.3mg/L。

M IC-1定量检测试剂盒（酶联免疫法）由中国医学科学院肿瘤医院生物检测中心研发，现为北京金紫晶生物医药技术有限公司产品。此试剂盒基于双抗体夹心的非竞争性免疫分析法，采用了生物素-亲和素放大系统，以伯乐酶标仪450 nm/ 655 nm双波长检测各孔的OD值，操作严格按照仪器和试剂使用说明书进行。吸光度与校准品和血清样品中的M IC-1浓度成正比，可通过剂量-反应曲线得出样品中的M IC-1浓度。M IC-1的临界参考值为1000 pg/m l。

1.3 统计学处理

血清中M IC-1的浓度用均数±标准差（x±s）表示。应用SPSS 19.0软件进行统计分析，Kruskal–Wallis检验用于分析多组间的M IC-1血清水平差异；Mann-Whitney u检验用于分析两组间的M IC-1水平差异；ROC曲线用于分析各血清标志物的诊断效能。统计学检验均为双侧检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肺癌患者与正常人群血清中的MIC-1水平

分别检测肺癌患者与正常人群血清中的M IC-1水平，结果发现肺癌患者血清中M IC-1浓度（1777.56 pg/m l±1100.09 pg/m l）显著高于正常人群的M IC-1浓度（588.94 pg/m l±220.62 pg/m l），且组间差异具有统计学意义（P＜0.001，图1）。

2.2 不同分期的肺癌患者血清MIC-1水平比较

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者的血清M IC-1水平随临床分期的进展呈上升的趋势（P＜0.001，Kruskal-Wallis检验；图2A）。Ⅳ期患者的血清M IC-1水平高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者的血清M IC-1水平，且组间差异均具有统计学意义（P＜0.001，P＜0.001，P= 0.024）；Ⅰ、Ⅱ期患者的血清M IC-1水平之间的差异不具有统计学意义（分别为P=0.808），Ⅱ、Ⅲ期患者的血清M IC-1水平之间的差异也不具有统计学意义（P=0.131）；而Ⅲ期患者的血清M IC-1水平与Ⅰ期患者的相比，组间差异具有统计学意义（P=0.048）。

肺癌早期（Ⅰ、Ⅱ期）患者的血清M IC-1水平低于晚期（Ⅲ、Ⅳ期）患者的血清M IC-1水平，且组间差异具有非常显著的统计学意义（P＜0.001，图2B）。以上结果提示M IC-1在早期诊断和病情评价方面具有较为显著的临床意义。

血清M IC-1水平与肿瘤浸润程度、淋巴结受累情况、远端转移情况均有关（分别为P＜0.001、 P=0.02、P＜0.001，Kruskal-Wallis检验；图3）。

肿瘤最大直径≤3 cm，被肺或脏层胸膜包绕，未侵及叶支气管近端的T1期患者的血清M IC-1水平显著低于T2期、T3期和T4期患者的血清M IC-1水平，且组间差异均具有统计学意义（均P＜0.001），而T2期、T3期和T4期患者血清M IC-1水平之间的差异不具有统计学意义（P=0.324，Kruskal-Wallis检验；图3A）。

无淋巴结转移（N0期）患者的血清M IC-1水平低于有淋巴结转移（N1~3期）患者，组间差异具有统计学意义（P=0.037，图3B）。

有远端转移（M1期）患者的血清M IC-1水平显著高于无远端转移（M0期）患者，组间差异具有非常显著的统计学意义（P＜0.001，图3C）。

2.3 肺癌分化程度与血清MIC-1水平的关系

肺癌患者的血清M IC-1水平随分化程度的不同而具有非常显著的统计学意义（P＜0.001，Kruskal-Wallis检验；图4）。

低分化患者的血清M IC-1水平与中低分化、中高分化患者的血清M IC-1水平相比，组间差异均具有统计学意义（分别为P=0.029，P=0.04）；与高分化患者的血清M IC-1水平相比，组间差异具有非常显著的统计学意义（P＜0.001）。中低分化患者的血清M IC-1水平高于高分化患者的血清M IC-1水平，且组间差异具有统计意义（P= 0.021）；中分化患者的血清M IC-1水平也高于高分化患者的血清M IC-1水平，且组间差异具有非常显著的统计学意义（P=0.001）。

研究还发现，在肺癌的不同病理类型间（鳞癌、腺癌、小细胞癌），肺癌患者血清M IC-1水平的差异均不具有统计学意义（P=0.170，Kruskal-Wallis检验）。

2.4 ROC曲线

依据患者与正常人群的血清各肿瘤标志物浓度绘制ROC曲线（图5）。结果显示，M IC-1的AUC为0.915，高于临床现有肺癌诊断标志物CA125、NSE、SCC和CEA（AUC分别为0.850、0.832、0.804和0.750）。由于未检测正常人群CYFRA21-1浓度，此ROC曲线不含CYFRA21-1。

2.5 MIC-1在肺癌诊断中的价值及各肿瘤标志物联合应用的价值

以M IC-1为指标诊断肺癌时的特异度与目前临床上常用的检测指标得出的特异度无明显差异（表1）；其诊断肺癌时的敏感度为76.6%，显著高于其他五种临床常用检测指标的敏感度，甚至高于此五种标志物联合应用时的敏感度（72.2%，表2）。

表1 肺癌患者中血清肿瘤标志物诊断的AUC值及诊断价值

肺癌早期诊断分析结果显示：M IC-1诊断Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期肺癌的敏感度分别为70.2%、69.9%、79.2%和88.7%，均高于其他五种常用标志物的敏感度；其中M IC-1诊断Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期肺癌的敏感度明显高于五种常用标志物中敏感度最高的CYFRA21-1（Ⅰ期：20.7%；Ⅱ期：52.1%；Ⅲ期：57.1%）。而M IC-1联合其他五种标志物可极大地提高肺癌的早期诊断敏感度（Ⅰ期：79.8%；Ⅱ期：87.7%）。结果提示，以M IC-1为主的多肿瘤标志物联合检测对肺癌的辅助诊断具有非常重要的价值（表2）。

通过对不同病理类型的肺癌（鳞癌、腺癌、小细胞癌）进行分层分析发现，M IC-1在鳞癌、腺癌、小细胞癌这三种主要类型的肺癌中均显示出较高的诊断敏感度，能达到甚至超过其他五种标志物的联合诊断水平（81.6%vs 82.8%；74.7%vs 68.9%；84.9%vs 83.0%）。M IC-1与五种标志物的联合应用可进一步显著提高不同病理类型肺癌诊断时的敏感度（鳞癌：96.3%；腺癌：88.1%；小细胞癌：96.2%；表3）。

3 讨论

肿瘤标志物检测已成为肺癌诊断中的一种重要辅助手段，但是临床常用肿瘤标志物检测的敏感度普遍较低[8-9]，难以满足日益增加的临床诊断需求。因此，寻找一种敏感度更高且适于大规模人群筛查的标志物，最终实现节约医疗资源，以及提高医疗资源利用率和肺癌患者的临床疗效，是医疗工作者面临的重要课题。

表2 血清肿瘤标志物在不同肺癌临床分期中的敏感度（例）

M IC-1是一种新的、广谱的肿瘤标志物，广泛参与细胞凋亡、侵袭及转移等生物学过程。正常人群血清中M IC-1蛋白呈低水平稳定表达，在炎症、急性损伤或肿瘤等病理状态时表达水平显著升高[10-11]。张伟等[7-8，11-12]的前期研究显示，M IC-1

表达水平在多种肿瘤患者的血清中均有明显的提高，显示出其作为肿瘤标志物的重要价值。

表3 各标志物在不同类型肺癌中的敏感度（例）

本研究应用自主研发的双抗体夹心ELISA血清M IC-1检测试剂盒，对肺癌患者与正常人群进行了血清学研究，发现肺癌患者血清M IC-1水平显著高于正常人群（P＜0.001）。而对其进行更深层次的分析发现，血清M IC-1水平随肺癌临床分期的升高而上升（P＜0.001，Krustal-Wallis检验），晚期（Ⅲ期、Ⅳ期）患者血清M IC-1水平显著高于早期（Ⅰ期、Ⅱ期）患者（P＜0.001），提示其有评价病情的价值。在T分期中，T1期患者血清M IC-1水平显著低于T2期、T3期和T4期患者（均P＜0.001）；在N分期中，无淋巴结转移（N0期）患者的血清M IC-1表达显著低于有淋巴结转移（N1~3期）患者（P=0.037）；在M分期中，有远端转移患者血清M IC-1水平也显著高于无远端转移患者（P＜0.001）。另外，本研究还发现，肺癌患者血清M IC-1水平随分化程度的不同存在非常显著的统计学意义（P＜0.001，Krustal-Wallis检验），从高分化到低分化，患者血清M IC-1水平表达水平有升高的趋势。

本研究比较了M IC-1与CEA、CA125、NSE、SCC、Cyfra21-1等常用肺癌诊断肿瘤标志物敏感度的差异，发现在血清M IC-1水平的临界值为1000 pg/m l、诊断特异度为96.9%时，其诊断的敏感度要远远高于其他标志物（具体见表1）。M IC-1对鳞癌、腺癌、小细胞癌的诊断敏感度能达到甚至超过其他五种标志物联合诊断的敏感度。尤其对于Ⅰ期、Ⅱ期肺癌患者，M IC-1的诊断敏感度大幅地超过了其他标志物（Ⅰ期的诊断敏感度提高了50%～70%，Ⅱ期的敏感度提高了15%～60%），这提示M IC-1对于肺癌尤其是早期肺癌患者的诊断具有重要的价值。

临床实践证明，单一肿瘤标志物的诊断往往难以满足临床诊断的需要，而肿瘤标志物联合诊断的应用也越来越广泛。本研究表明，多种肿瘤标志物联合诊断的敏感度显著高于任何单一指标肿瘤标志物诊断的敏感度。尤其在肺癌早期，以M IC-1为主的六种肿瘤标志物联合诊断的敏感度（Ⅰ期：79.8%；Ⅱ期：87.7%）显著高于其他五种肿瘤标志物联合诊断的敏感度（Ⅰ期：44.9%，Ⅱ期：72.6%）。

以上数据显示，M IC-1作为一种新的肿瘤标志物在早期肺癌辅助诊断中具有重要应用价值，多种肿瘤标志物联合检测可进一步提高肺癌辅助诊断的临床价值；辅以其他肺癌诊断指标，能显著提高M IC-1诊断肺癌的敏感度。综上所述，M IC-1在正常人群体检和肺癌筛查方面均具有重大的潜在临床应用价值。

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Clinicalsignificance ofmacrophages inhibitory cytokine-1 and the combinationw ith multiplebiomarkers in the diagnosisand early diagnosisof lung cancer△

ZHANGChao1TIAN Hai-mei1LIMo1WANG Teng1LIYan-fen1LIU Jing1YANG Ta-na2WANG Xiaobing1ZHAOWen-ya1SHEN Di3QIJun3ZHANGWei1#

1Detection Center of Tumor Biology,3Clinical Laboratory,Cancer Instituteand Hospital,Chinese Academy ofMedical Sciencesand Peking Union MedicalCollege,Beijing 10021,China

2Inspection Center,Beijing Children Hospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing 100045,China

ObjectiveTo investigate the accessory diagnostic value of macrophage inhibitory cytokine-1(M IC-1) in patients w ith lung cancer,and estimate the clinical value of M IC-1 in combination w ith other biomarkers in the screening of early-stage lung cancer.MethodThe levels and distribution of M IC-1,CEA,CA125,NSE,SCC and Cyfra21-1 in serum samples from 663 previously untreated patients w ith different clinical stages of lung cancer and 488 healthy normal subjects were analyzed by self-produced M IC-1 double antibody sandw ich ELISA Kit and RocheCobas 601 ECL analyzer,respectively.The association of the serum levels of M IC-1 w ith clinical stages,pathologic types,and degrees of differentiation were analyzed.Additionally,the clinical value of M IC-1 and the combined biomarkers was explored.ResultThe serum levels of M IC-1 in patientsw ith lung cancer were significantly higher than those in healthy control(P<0.001).A stepw ise increase of M IC-1 levels was noted w ith the progress of lung cancer (P<0.001),and the levels were significantly correlated w ith the depth of tumor invasion(P<0.001),lymph node metastasis(P=0.02),remotemetastasis(P<0.001)and degrees of differentiation(P<0.001).The sensitivity of M IC-1 was even superior to the parallel test of the other five biomarkers(76.6%vs 72.2%),specifically,displaying comparable or exceeding results in different pathological type of squamous carcinoma,adenocarcinoma and small-cell lung cancer (81.6%vs 82.8%;74.7%vs 68.9%;84.9%vs 83.0%).Furthermore,the sensitivities of M IC-1 combined w ith the other five biomarkers in early-stage lung cancer were significantly increased from 44.9%to 79.8%in stage I and from 72.6%to 87.7%in stage II lung cancer.ConclusionM IC-1 is a valuable biomarker of lung cancer,especially in detection of early-stage lung cancer.The results imply that the parallel test of M IC-1 w ith CEA,CA125,NSE,SCC and Cyfra21-1may have important clinical value in physical examination and in the diagnosis of early-stage lung cancer.

lung cancer;macrophages inhibitory cytokine-1;combined detection;early diagnosis

R734.2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.03.15

国家高技术研究发展计划（863计划）（2008AA 02Z415）；国家自然科学基金（81441080）首都特色临床应用研究（Z121107001012066）；

#通信作者（corresponding author），e-mail：zhangww1954@126.com

2015-01-19）