SLC-Her--Her-22/neu-Pneu-P5353-Fc-Fc融合基因重组腺病毒表达载体的构建及检测

王慰敏孙文欣钱海利王海娟张叔人林晨#

安交通大学第一附属医院妇产科，西安 710061

国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室，北京100021

恶性肿瘤是当今危害人类健康的第二大疾病。随着分子生物学技术的发展，肿瘤疫苗成为目前的研究热点。肿瘤基因/DNA疫苗，是将编码肿瘤抗原（相关/特异抗原）的基因克隆到真核表达载体上，然后将重组的质粒DNA导入机体内，让外源基因在体内表达，产生蛋白抗原刺激机体免疫系统，引发免疫反应，增强机体的抗肿瘤能力。利用外源性肿瘤抗原基因能够提高和诱导机体的特异性抗肿瘤免疫反应以靶向杀伤肿瘤细胞，有可喜的应用前景。但同时面临一些亟待解决的问题，如有价值的目的基因少，单基因疫苗为主难以激发较强的免疫应答，肿瘤基因的免疫耐受等。以“肿瘤趋化抗原核酸疫苗”为构想，我们拟选择应用前景较好的c-erbB-2（Her-2/neu）基因及p53基因作为抗原基因进行融合，并在其上游和下游分别连接趋化因子SLC和免疫球蛋白的Fc段基因形成SLC-HP-Fc融合基因，并以腺病毒作为基因治疗载体，采用分子生物学手段构建携带融合基因SLC-Her-2/neu-P53-Fc的重组腺病毒真核表达载体，为进一步研究该融合基因与肿瘤相关作用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 细胞株、质粒 人胚肾293细胞、E.coli DH5α大肠杆菌感受态及E.coli BJ5183甘油菌（本实验室冻存）。pcDNA3.1-SLC-Her-2/neu-P53-N质粒（本实验室孙文欣构建）、骨架质粒pAdEasy-1（本实验室保存）、穿梭载体pShuttle-CMV-sig-Fc（中国医学科学院肿瘤研究所免疫室覃汉军博士构建）。

1.1.2 试剂与耗材 细胞培养基DMEM（GIBCO BRL公司），胎牛血清（GIBCO BRL公司），Lipofectamine2000（INVITROGEN公司），限制性核酸内切酶KpnⅠ、PmeI、EcoRⅤ、PacI、BamHⅠ（Takara宝生物公司），RNA酶（Boehringer Mannheim公司），DNA聚合酶（Takara宝生物公司），pfu高保真DNA聚合酶（上海生工），dNTP（Boehringer Mannheim公司），oligo-dT（Promega公司），DNA快速纯化回收试剂盒（博大泰克公司）。

1.2 方法

1.2.1 携带SLC-HP C-HP基因的腺病毒穿梭载体（p Shuttle-CMV-SLC-HP-Fc P-Fc）的构建及鉴定 分别将pShuttle-CMV-sig-Fc、pcDNA3.1-SLC-Her-2/neu-P53-N（C-N）用KpnⅠ和EcoRⅤ进行双酶切，酶切产物经胶回收试剂盒纯化后，按照2:3的摩尔比混合，16℃下经T4酶连接3～4 h。产物转入DH5α感受态细菌，利用卡那霉素抗性LB平板于37℃下培养12～16 h。挑选单个抗性小菌落，在含卡那霉素的5 ml LB培养液中于37℃下振荡过夜，扩增后使用碱裂解法小量提取质粒。经KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切鉴定筛选pShuttle-CMV-SLC-HP-Fc重组穿梭质粒。

1.2.2 BJ-Ad Easy asyTMTM细菌的构建及鉴定 在氨苄青霉素抗性的LB平板上于37℃下培养10～14 h，筛选含pAdEasy-1质粒的大肠杆菌DH10B甘油菌，扩增后使用碱裂解法小量提取质粒。用氯化钙法将骨架质粒pAdEasy-1转入BJ5183感受态菌中，在链霉素和氨苄青霉素双抗性的LB平板上进行筛选，挑选较饱满克隆小提质粒，应用λHindⅢ酶切鉴定，正确的细菌克隆命名为BJ-AdEasyTM细菌。

1.2.3 重组腺病毒AdEasy EasyTMTM-SLC-HP-Fc P-Fc的构建及鉴定 重组pShuttle-CMV-SLC-HP-Fc质粒应用限制性内切酶PmeⅠ酶切线性化，经酚、氯仿抽提后将2µl线性化穿梭质粒转入200µl BJ-AdEasyTM感受态细菌中，后接种于含有卡那霉素抗性的LB平板并倒置，于37℃下培养16～20 h。挑选较小菌落于LB培养液中扩增后使用碱裂解法小量提取质粒并应用PacⅠ酶切鉴定。重组成功的腺病毒质粒转入E.coli.DH5α扩增，用卡那霉素抗性LB平板培养后挑选抗性菌落，通过目的基因PCR及BamHⅠ酶切后电泳进行鉴定。并应用Vigrous质粒大量提取纯化试剂盒大量提取并纯化重组质粒DNA，保存于-20℃，以备细胞转染。

1.2..44重组腺病毒的制备及鉴定 转染前一天将人胚肾293细胞接种于25 cm2细胞培养瓶中，不加抗生素，当细胞生长至约为70%，使用脂质体Lipofectamine2000将线性化的重组质粒转染293细胞。于37℃、5%CO2、含5%胎牛血清的DMEM培养基中培养，转染后第三天分瓶，观察细胞形态变化，当细胞完全出现病变效应时同时收集细胞及上清液。当大部分细胞出现病变效应时取等量的上清液和蛋白酶K混和液处理，利用腺病毒骨架质粒引物和SLC-HP特异性引物分别进行PCR鉴定重组病毒。

1.2..55重组腺病毒的扩增、纯化及保存 将收集后鉴定正确的含有原代AdEasyTM-SLC-HP-Fc的293细胞在-80℃冻存1 h后于37℃溶解20 min，反复3次充分裂解细胞，在4℃下以12000 rpm/min离心10 min，收集上清液再次接种293细胞，细胞出现完全病变时离心弃去培养液，细胞团块经少量PBS重悬后于-80℃冻存。经细胞反复冻融病毒液感染293细胞使重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HPFc不断得到扩增，并采用氯化铯梯度离心法纯化腺病毒分装到Eppendorf管中，加入10%甘油，保存于-80℃。

2 结果

2.1 腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-SLC-HP-FC的鉴定

含目的基因的质粒pcDNA3.1-SLC-Her-2/neu-P53-N（C-N）经KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切后定向克隆入穿梭载体pShuttle-CMV-sig-Fc，构建重组质粒pShuttle-CMV-SLC-HP-Fc，提取质粒DNA进行KpnⅠ和EcoRⅤ行双酶切分析得到1.1 kb的SLCHP片段，表明目的片段已经插入重组质粒（图1）。

图1 pShuttle-CMV-SLC-HP-Fc的KpnⅠ/EcoRⅤ酶切

2.2 BJ-AdEasyTM细菌的鉴定

如图2所示，将pAdEasy-1质粒转入BJ5183感受态细菌中，经抗生素平板筛选后提取质粒，应用λHindⅢ酶切后可见两条带，大条带与pAdEasy-1骨架质粒大小相近，说明腺病毒骨架质粒pAdEasy-1已经成功转入BJ-AdEasyTM感受态细菌中。

图2 BJ-AdEasyTM细菌的酶切鉴定

2.3 融合基因SLC-Her-2/neu-P53-Fc 真核表达载体的构建及鉴定

穿梭载体pShuttle-CMV-SLC-HP-Fc转入BJAdEasyTM细菌中，使腺病毒骨架质粒与穿梭质粒发生同源重组。提取克隆5、9、10质粒进行BamHⅠ酶切，经电泳后得到大小为22 kb和11 kb的两条带（图3）。同时对克隆5、9、10中目的基因SLC-HP进行PCR扩增鉴定，结果显示克隆5、9同源重组的腺病毒质粒中有1.1 kb的条带，说明同源重组成功，命名为AdEasyTM-SLC-HP-Fc质粒（图4）；克隆10中无条带，说明重组失败。将重组质粒经脂质体Lipofectamine2000转染至293细胞，大约15天，细胞出现病变（图5），说明此时细胞内已有成熟的腺病毒颗粒包装并释放入上清液中。收集包装后释放到上清液中的重组腺病毒进行PCR鉴定，利用腺病毒骨架质粒引物和SLC-HP特异性引物分别进行PCR鉴定。结果显示腺病毒携带的目的基因SLC-HP的PCR检测中出现1.1 kb条带（图6），表明AdEasyTM-SLC-HP-Fc已在293细胞内包装成功。

图3 Ad-SLC-HP-Fc-BJ5183细菌的酶切鉴定

图4 目的基因PCR鉴定

图5 转染前后的293细胞（×100倍）

图6 重组腺病毒中目的基因PCR鉴定

2.4 Ad Easy TM-SLC-HP-Fc病毒库的建立

保留部分原代重组腺病毒，用原代AdEasyTMSLC-HP-Fc在293细胞中扩增后保留第一代至第五代的AdEasyTM-SLC-HP-Fc作为种子库。用种子病毒库中的AdEasyTM-SLC-HP-Fc进一步在293细胞中扩增并收集AdEasyTM-SLC-HP-Fc，构建工作病毒库。而后用工作病毒库中的AdEasyTM-SLCHP-Fc进一步扩增病毒，积累收集的病毒用于进一步实验。

3 讨论

随着分子生物学领域的迅猛发展，特别是DNA重组技术及基因工程的发展，使得基因治疗成为当下抗肿瘤治疗的热点之一。基因治疗是将外源基因插入合适的表达载体，再以重组载体转染靶细胞，使目的基因在靶细胞或体内高效表达，从而达到治疗目的。目前已经发现许多肿瘤相关基因，且部分基因已经在抗肿瘤研究的实验阶段甚至临床阶段取得了可喜成绩。

Her-2/neu基因，是人类肿瘤中最常见发生变化的癌基因之一。在多种肿瘤中发现了Her-2/neu基因的过度表达。研究表明人类肿瘤组织中约有30%存在c-erbB-2基因的高表达，且这种高表达和肿瘤的转移行为及预后不良有关[1-4]。目前国内外对Her-2/neu基因的靶向抗肿瘤研究较多，其中单克隆抗体Herceptin已在临床应用于乳腺癌。p53基因是临床发现与肿瘤生长相关性最高的抑癌基因之一。野生型p53基因在细胞周期的调节、DNA的修复及细胞凋亡中起着关键作用[5]。很多研究已经证明在肿瘤的发生过程中存在p53基因的变异及失活[6-7]。临床试验表明导入外源重组腺病毒rAd-p53对结肠癌、肺癌、卵巢癌及头颈部肿瘤等有抗肿瘤作用[8-10]。鉴于c-erbB-2及p53基因与肿瘤发生的密切关系及各自靶向抗肿瘤研究所取得成绩，本实验室将二者进行基因融合形成HP融合基因，并联合应用次级淋巴组织趋化性细胞因子（SLC）和IgG Fc的佐剂效应来增强机体对肿瘤抗原的反应性和免疫效应细胞的活性[11]。Sun[12]等将融合基因SLC-HP通过基因枪导入C57BL/6小鼠体内，结果显示该基因对小鼠黑色素瘤的预防和治疗有良好效果。为了使该融合基因更早应用于临床发挥抗肿瘤作用，本研究采用技术较成熟的腺病毒作为基因导入宿主细胞的载体，构建了AdEasyTM-SLC-HP-Fc重组腺病毒真核表达载体。

腺病毒是目前基因治疗最常用的载体之一，主要是其具有宿主范围广，可感染分裂和非分裂细胞、且感染能力强、滴度高、安全性佳，病毒基因组不整合宿主染色体，外源性基因目的蛋白表达水平高，基因容量较大以及可选择型别多等优点[13-15]。本实验采用当今广泛应用的AdEasy系，简化了载体的构建过程，实验周期短，对实验设备要求不高，且利用两步感受态转化法在原核细胞E.coli BJ5183中完成同源重组，制备的BJ-Ad-EasyTM细菌可供同时制备多种重组腺病毒使用。AdEasyTM-SLC-HP-Fc在293细胞中包装鉴定成功后并通过其扩增，建立了重组腺病毒AdEasyTMSLC-HP-Fc种子病毒库和工作病毒库，为该疫苗的进一步研究奠定了实验基础。

本研究成功地构建了腺病毒AdEasyTM-SLCHP-Fc真核表达载体，目前国内尚未有类似报道，为进一步通过动物实验及临床实验探索一种高效而广谱的抗肿瘤疫苗奠定了实验基础。

［1］Lee JW,Soung YH,Seo SH,et al.Somatic mutations of ERBB2 kinase domain in gastric,colorectal,and breast carcinomas[J].Clin Cancer Res,2006,12(1):57-61.

［2］Bernhard H,Neudorfer J,Gebhard K,et al.Adoptive transfer of autologous,HER2-specific,cytotoxic T lymphocytes for the treatment of HER2-overexpressing breast cancer[J].Cancer Immunol Immunother,2008,57(2):271-280.

［3］Zhang XL,Yang YS,Xu DP,et al.Comparative study on overexpression of HER2/neu and HER3 in gastric cancer[J].World JSurg,2009,33(10):2112-2118.

［4］Jørgensen JT.Targeted HER2 treatment in advanced gastric cancer[J].Oncology,2010,78(1):26-33.

［5］Nigro JM,Baker SJ,Preisinger AC,et al.Mutations in the p53 gene occur in diverse human tumour types[J].Nature,1989,342(6250):705-708.

［6］Ries JC,Schreiner D,Steininger H,et al.p53 mutation and detection of p53 protein expression in oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma[J].Anticancer Res,1998,18(3B):2031-2036.

［7］Sakai E,Ts uchida N.Most human squamous cell carcinomas in the oral cavity contain mutated p53 tumor-suppressor genes[J].Oncogene,1992,7(5):927-933.

［8］Lang FF,Bruner JM,Fuller GN,et al.Phase I trial of adenovirus-mediated p53 gene therapy for recurrent glioma:biological and clinical results[J].J Clin Oncol,2003,21(13):2508-2518.

［9］Li Y,Li LJ,Zhang ST,et al.In vitro and clinical studies of gene therapy with recombinant human adenovirusp53 injection for oral leukoplakia[J].Clin Cancer Res,2009,15(21):6724-6731.

［10］Pan JJ,Zhang SW,Chen CB,et al.Effect of recombinant adenovirus-p53 combined with radiotherapy on long-term prognosis of advanced nasopharyngeal carcinoma[J].J Clin Oncol,2009,27(5):799-804.

［11］Terando A,Roessler B,MuléJJ.Chemokine gene modification of human dendritic cell-based tumor vaccines using a recombinant adenoviral vector[J].Cancer Gene Ther,2004,11(3):165-173.

［12］Sun W,Qian H,Zhang X,et al.Induction of protective and therapeutic antitumour immunity using a novel tumour-associated antigen-specific DNA vaccine[J].Immunol Cel l Bi ol,2006,84(5):4.47.

［13］Hartman ZC,Appledorn DM,Amalfitano A.Adenovims vector induced innate immune responses:impact upon efficacy and toxicity in gene therapy and vaccine applications[J].Virus Res,2008,132(1-2):l-14.

［14］Jager L,Ehrhardt A.Emerging adenoviral voctor for stable correction of genetic disorder[J].Curt Gene Ther,2007,7(4):272-283.

［15］Douglas JT.Adenoviral vectors for gene therapy[J].Mol Biotechnol,2007,36(1):71-80.