复发转移性乳腺癌患者血浆miRNA表达水平与临床病理特征、化疗疗效及预后关系的研究

邵彬李惠平#朱军邸立军宋国红姜晗昉梁旭王超颖严颖林晓琳王丽娜宛凤玲袁艳华尤渺宁

北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所1乳腺肿瘤内科，2淋巴肿瘤内科，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京100142

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，转移和复发是导致患者死亡的主要原因[1]。当肿瘤局限在乳腺中时，其治愈率超过90%；而当癌细胞发生远处转移后，其5年生存率低于30%[2]。晚期乳腺癌的治疗是以化疗为主的综合治疗，而一线化疗的有效率为30%～50%，二线化疗的有效率则更低[3]。因此，如何提高化疗的有效率是临床治疗成功的关键。随着分子生物学及病理学的进展，化疗相关预测及预后因子的研究已成为热点。

microRNA（miRNA）是一类长度为20～24个核苷酸的具有调控功能的非编码RNA。其主要功能是对编码mRNA进行转录后调节，其中大多数的miRNA可通过与靶基因mRNA的3'端非翻译区（untranslated region，UTR）的完全或不完全的互补结合而降解mRNA或抑制mRNA的表达，进而影响细胞的增殖、凋亡和分化。近年来，miRNA与肿瘤的发生发展，以及与预后和药物敏感性的研究均有一定的报道，这提示miRNA可能为肿瘤耐药机制的研究提供了新的思路。自Lawire等[4]首次在人血清中分离出miRNA后，多项研究已经证实：miRNA分子广泛存在于血清和血浆中，并且随着生理状况、疾病的种类和病程的不同，miRNA分子在血清和血浆中存在的种类和表达水平将发生变化。且晚期乳腺癌患者组织标本获取困难，这为血清或血浆miRNA作为疾病无创诊断和预后的分子标志物提供了可能[5-6]。

本研究拟通过检测复发转移性乳腺癌患者各血浆 miRNA（包括血浆miR-16、miR-34a、miR-200a、miR-375、miR-451）的化疗前、后的表达水平，探讨血浆中miR-16、miR-34a、miR-200a、miR-375、miR-451化疗前、后表达水平与乳腺癌临床病理特征、化疗疗效及预后之间的关系，以为复发转移性乳腺癌的治疗提供依据。

1 资料和方法

1.1 临床资料

选取2009年6月至2013年12月在北京肿瘤医院乳腺肿瘤内科治疗的79例复发转移性乳腺癌患者，所有病例均经术后组织或穿刺病理证实。美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）体能状态评分为0～1分；患者中位年龄为54岁（30～81岁）；其中浸润性导管癌有75例，浸润性小叶癌有1例，其他类型有3例；免疫组化结果为雌激素受体（estrogen receptor，ER）呈阳性者有52例，呈阴性者为26例，1例不详；孕激素受体（progestrogen receptor，PR）呈阳性者为45例，呈阴性者为33例，1例不详；激素受体（hormone receptor，HR）阳性者（ER或PR有一项阳性或均为阳性）为57例，呈阴性者为21例，1例不详；人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）呈阳性者为15例，呈阴性者为58例，6例不详；手术时原位癌患者为1例，分期为Ⅰ期者为8例，Ⅱ期者为29例，Ⅲ期者为29例，Ⅳ期者为7例，另外有5例分期不详；复发转移患者均经影像学证实；无内脏转移者为26例，有内脏转移者为53例，其中肺转移31例，肝转移29例，骨转移35例，淋巴转移48例，胸壁复发18例，脑转移3例，恶性胸腔积液17例，恶性心包积液7例，骨髓转移1例，软组织转移1例，伴发宫颈癌1例。79例患者中2例患者化疗线数不详。本项目所有研究对象均签署了关于在本研究中使用其血液样本的知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 患者的治疗和评估 所 有患者接受两药联合方案：多西他赛75 mg/m2+塞替哌75 mg/m2，d1，每3周为一个周期，共6个周期。分别在2个周期、4个周期及6个周期后（4、6个周期后仍常规影像学评效检查，但未抽取血样）评其疗效。应用RESCIST标准评估患者对治疗的反应：完全缓解（complete response，CR）为所有目标病灶完全消失；部分缓解（partial response，PR）为基线病灶长径总和缩小≥30%；疾病进展（progressive disease，PD）为基线病灶长径总和增加≥20%或出现新的病灶；疾病稳定（stable disease，SD）为基线病灶长径总和缩小但未达PR或增加未达PD。ORR=CR+PR，临床获益率（clinical benefit rate，CBR）=CR+PR+SD（维持时间大于3个月）。无进展生存时间为复发转移后化疗第1天至疾病进展时间；总生存时间为化疗第1天至患者死亡。

1.2..22血液标本的收集和制备 分别采集患者化疗前及2个周期后评价时的外周血4 ml，放置于含肝素的抗凝管中。在采集后2 h内将外周血以2000 r/min的转速离心15 min，分离成血浆和细胞成分，血浆储存在－80℃冰箱内备用。

1.2..33 qRT-PCR -PCR检测 应用PrimeScript™反转录试剂盒（购自于日本Takara Bio Inc公司）直接对血浆标本进行反转录合成cDNA。其中反转录混合反应液如下：5×PrimeScript缓冲液 4 μl；Prime-Script反转录混合酶Ⅰ1μl；miR-16、miR-34a、miR-200a、miR-375、miR-451反转录引物各2 μl；血浆10μl；加DEPC水至总体积20μl。在PCR扩增仪进行反转录反应，反应条件为25℃10 min，42℃30min，85℃ 5 min；反应结束后，将合成的cDNA样品用蒸馏水稀释至100μl置于冰上待用或于－20℃下保存，然后进行Real-time PCR反应。miRNA反转录引物及PCR引物均购自广州锐博生物科技有限公司。应用ABI®900HT Fast型Real-Time PCR（购自美国Life technology公司）检测系统。25 μl体系配制如下：miR-16、miR-34a、miR-200a、miR-375和miR-451正向和反向引物（10μM）各 1 μl；cDNA 产物1 μl；Taq DNA 聚合酶（5 U/μl）0.2 μl；10×Real-time PCR缓冲液3 μl；dNTP（10 μM）0.3μl；加水至总体积为25μl。进行PCR反应时，95℃下持续2 min使双链DNA预变性，95℃下持续15 s使之变性，60℃下持续1 min进行退火及延伸，以上为一个循环，共进行40个循环的扩增。设定统一的Ct阈值分析实验结果，取3次实验的平均值。由于血浆中缺乏有效的对照，本研究采用GenEx version6软件、Normfinder软件和Genorm软件确定内对照为miR-34a，且通过实验发现该对照在血浆中表达稳定。患者各血浆miRNA相对表达水平均采用公式2-ΔCt计算，其中ΔCt=Ct目标miRNA－Ct对照miRNA。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 16.0软件进行分析，采用χ2检 验比较患者 miR-16、miR-200a、miR-375 和miR-451化疗前表达水平的变化与临床病理特征、化疗疗效的关系。采用χ2检验检测患者各种临床病理特征对临床获益的影响。采用多因素回归分析方法分析单因素分析中对ORR有意义的因素。采用Kaplan-Meier分析和Cox多因素回归分析检测患者临床病理特征及各血浆miRNA对于PFS及OS的影响。P值为双向性检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 血浆miRNA化疗前的表达水平与患者临床病理特征之间的关系

根据患者各血浆miRNA中位表达水平分为高表达组和低表达组。血浆miR-16、miR-200a、miR-375和miR-451化疗前的表达水平与患者临床病理特征关系的分析结果显示，化疗前血浆miR-451的表达与患者ER或HR状态显著相关，miR-451高表达组的患者ER阳性率显著高于低表达者，组间差异具有统计学意义（P=0.025），分别为78.9%和55.0%；miR-451高表达组的患者HR阳性率显著高于低表达者，组间差异具有统计学意义（P=0.031），分别为84.2%和62.5%。

而其他血浆miRNA表达水平与其他临床病理特征如患者年龄、PR状态、HER2状态、内脏转移、脏器转移个数及化疗线数无显著相关（表1）。

2.2 血浆miRNA化疗前、后表达水平与患者化疗疗效及生存时间的关系

2 2..2.1血浆mi RNA化疗前、后表达水平与患者化疗疗效的关系 血浆miR-16、miR-200a、miR-451高表达组的PR与低表达组相比，组间差异具有统计学意义（分别为 P=0.001，P=0.034，P=0.008；表2）；血浆miR-200a化疗后表达水平降低组的PR与升高组相比，组间差异具有统计学意义（P=0.037，表3）。CBR（＋）患者中，血浆miR-200a及miR-451高表达组与低表达组相比，组间差异具有统计学意义（均P=0.002，表2）。ORR（＋）患者中，血浆miR-16高表达组与低表达组相比，组间差异具有统计学意义（P=0.03，表2）；血浆miR-200a化疗后表达水平降低组与升高组相比，组间差异具有统计学意义（P=0.01，表3）。而其他临床病理特征如患者年龄、ER状态、PR状态、HR状态、HER2状态、内脏转移、脏器转移个数、化疗线数及血浆miR-375与化疗疗效、CBR、ORR均无显著相关性（表4）。

进一步将单因素分析中有显著影响的miRNA进行多因素分析发现，无miRNA表达水平与患者PR、CBR具有显著相关性（P＞0.05）。其中，miR-200a化疗后表达水平变化与ORR显著相关（P=0.032），miR-200a化疗后表达升高者的ORR显著高于降低者，分别为57.9%和29.3%。

表1 复发转移性乳腺癌患者各血浆miRNA化疗前表达水平与患者临床病理特征的关系（例）

2.2..2 2血浆mi RNA化疗前、后表达水平与患者生存时间关系 miR-200a低表达组的PFS与高表达组相比，组间差异具有统计学意义（P=0.038），分别为10.2个月和5.2个月（表2）；血浆miR-200a化疗后表达水平升高组的PFS与降低组相比，组间差异具有统计学意义（P=0.009），分别为10.3个月和5.2个月（表3）。miR-16、miR-375、miR-451表达水平及化疗后变化对于患者PFS均无显著影响（表2，表3）。进一步行Cox回归分析发现miR-200a化疗后变化显著影响患者PFS（P=0.038，HR=2.016）。

miR-16、miR-200a、miR-375和miR-451表达水平及化疗后变化对OS均无显著影响（表2，表3）。而患者年龄、内脏转移及化疗线数均显著影响患者OS（表4）。进一步行COX回归分析患者化疗线数显著影响患者OS（P=0.046，HR=1.903）。

3 讨论

自Lawrie等[4]首次发现人血清中含有miRNA后，Chen等[6]和Mitchell等[7]几乎同时报道了人血浆或血清中存在着稳定的miRNA。Zhu等[8]在乳腺癌研究中发现癌组织与血清miRNA表达有显著差异。李振凤等[9]研究发现，与健康对照组相比，miR-21和miR-222在乳腺癌患者血浆中的表达明显升高，而miR-205在乳腺癌患者血浆中的表达明显下降。且血浆miR-21的表达水平与ER和PR相关，血浆miR-222的表达水平则在不同的肿瘤分期中表现不同。Anfossi等[10]研究发现，血清miR-19a在转移性炎性乳腺癌中呈显著升高，还发现HER2阳性的炎性转移性乳腺癌患者中，血清miR-19a高表达者PFS和OS显著延长。

表2 复发转移性乳腺癌患者各血浆mi RNA表达水平与患者化疗疗效及生存时间的关系（例）

miRNA能够被分泌到细胞外环境，并进入血液和其他体液中高稳定性循环。这种循环miRNA因其标本易获取，具有可多次取样的优点，所以得到了越来越多的研究者的关注。循环miRNA被包裹在外泌体（exosome）、微小体（microvesicle）或凋亡小体（apoptotic body）中，这些膜性结构对miRNA起到了有效的保护作用[11-12]。另外，血液中某些蛋白分子或脂质与miRNA的结合会使其具有抵抗RNase的能力[13]。因此，循环miRNA可以稳定存在。而miRNA是如何从组织细胞进入血液循环中，目前还不十分明了。据推测[14]，miRNA可能会像其他物质一样从破碎的组织细胞或调亡细胞中被动漏出，也可能是由有病变的组织和细胞主动分泌进入血液循环，而后者被认为是主要方式。据报道[15]，在多种病理状态下血液或其他体液中的一些miRNA的表达水平呈显著升高或降低。以上说明了循环miRNA在肿瘤的研究中可以作为很好的研究对象，可为肿瘤的研究提供新的方法和思路[16-19]。

循环miRNA的研究尚存在一些问题。既往的报道[20]表明循环miRNA表达水平的相关结果可重复性差，这种不一致性也说明了循环miRNA研究的困难性，由于各个研究采用的标本各异，检测平台的不同及内参miRNA的差异均可能造成结果的差异。各研究中检测的标本包括血浆、血清和全血，血浆和血清miRNA的含量相当，且血清的含量略高于血浆，而血清或血浆标本也同样可能会受到血细胞miRNA（包括miR-16、miR-150、miR-486-5p、let-7a、miR-574-3p、miR-223、miR-197、miR-451和miR-92a）的影响[21]；全血标本则包含了更多血细胞miRNA。同时各个研究应用的miRNA芯片、第二代DNA测序、定量PCR方法的不同也可能会造成结果的差异。而内参的选择也是循环miRNA定量的困难点，各个研究中miRNA在循环中的不稳定表达则造成了内参的选择各异。本研究中应用GenEx version 6软件并运行Normfinder和Genorm软件后发现，相对表达稳定可作为内对照的为miR-34a。miR-16在既往的多项研究中都作为内对照，因此，本研究中也将其纳入了检测[22]。本研究中，miR-16在各个样本中表达差异大，并不适合作内参基因。且既往研究[23-25]表明，miR-16在白血病、垂体瘤、前列腺癌、肺癌及头颈部肿瘤等多种肿瘤中存在异常表达，其调控的基因主要参与细胞周期的调控，包括Cyclin D1、Cyclin E、Bcl¯2等[26-28]。而本研究中，miR-16表达水平高低与化疗疗效显著相关，miR-16低表达患者疗效较好；但并未发现miR-16表达水平与临床病理特征的关系。

表3 3发转移性乳腺癌患者各血浆miRNA化疗后表达水平变化与患者化疗疗效及生存时间的关系（例）

miR-451在正常胃黏膜中表达明显高于在胃癌组织中的表达[29]。在头颈部鳞癌中的研究[30]发现，miR-451在术后无复发的患者中表达较复发患者高。同样，miR-451在低侵袭性的MCF-7乳腺癌细胞系的表达较MDB-231等高侵袭性细胞系中的表达高[31]。这些研究表明，miR-451在正常组织中发挥重要作用，而在病情进展时则出现表达水平下调。本研究中也发现miR-451高表达组的患者倾向于ER或HR表达阳性（p＜0.05），而既往细胞系的研究并未发现miR-451与ER具有调控关系[32]，由于本研究未进行下一步的细胞实验，尚不能证明miR-451与ER是否存在调控关系。在各血浆miRNA化疗前表达水平与患者化疗疗效的相关分析中发现，miR-451低表达组的PR与高表达组相比，组间差异具有统计学意义（P=0.008），高表达组的CBR与低表达组相比，组间差异具有统计学意义（P=0.002），而ORR两组无显著差异。这可能与肿瘤恶性程度低，患者化疗的CBR较高有关。Zhu等[33]的研究也证明了这一点，miR-451在多药耐药细胞系A2780DX5和KB-V1较敏感细胞系A2780和KB-3-1中显著上调，而拮抗miR-451后P-糖蛋白和多药耐药蛋白MDR1显著下降，从而逆转耐药。

目前的研究[34]表明，miRNA在乳腺癌耐药及上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的调控中发挥着重要作用。癌细胞在上皮间质化过程中获得了间质特性，容易从原位肿瘤中迁移，从而导致肿瘤浸润和远处转移[35]。在乳腺癌中，EMT与乳腺癌干细胞、三阴表型及基底样细胞紧密相关，也与TGF-β1、Wnt和Notch信号通路相关，并且与Snail、Slug、Twist和ZEB1/2等转录因子的调控相关[36]。miR-375在EMT中的作用尚不十分明确，Ward等[37]研究发现他莫西芬耐药的MCF-7细胞系中过表达miR-375可以使细胞系重新获得上皮样特征，这表明miR-375在EMT中具有重要作用。本研究也未发现miR-375表达水平与化疗疗效及生存时间具有相关性。

miR-200家族包括 miR-200a、miR-200b、miR-429、miR-200c和miR-141，这5个成员分为2个组群，分别位于1号及12号染色体上。miR-200家族参与EMT的调控，乳腺癌细胞系中的相关研究表明，miR-200可通过下调ZEB1和ZEDB2以抑制钙黏附蛋白 E（E-cadherin）的转录[38-39]。miR-200c在乳腺癌干细胞中通过抑制BMI-1的表达，从而抑制干细胞的自我更新，并造成乳腺癌干细胞体外扩增的下降。Hu等[40]报道卵巢癌miR-200a高表达患者会出现预后不良，且高表达者的中位生存时间显著短于低表达者的，分别为27.5个月和61个月。而在乳腺癌的相关研究[41]中发现，miR-200a与患者淋巴结及远处转移相关，是影响预后的重要因素。而化生性乳腺癌患者，miR-200a高表达患者，表型为三阴性的患者及HER2阳性乳腺癌患者较ER阳性患者表达明显降低，这些均表明miR-200家族与EMT及乳腺癌亚型相关[42]。EMT与肿瘤细胞耐药性的获得密切相关，EMT可以被抗肿瘤药物、放疗或低氧条件诱导发生，间质表型的肿瘤细胞比上皮表型的肿瘤细胞更容易获得耐药性。本研究中发现血浆miR-200a化疗后表达水平降低组的PR与升高组相比，组间差异具有统计学意义（P=0.034），而且化疗后表达变化同样会显著影响患者的化疗疗效（P=0.037），化疗后表达升高组ORR显著高于降低组（P=0.01）。而进一步多因素分析发现，miR-200a化疗后升高患者ORR仍显著高于降低者（P=0.032）。在生存时间的分析中发现，miR-200a化疗前低表达组PFS较高表达组显著延长（P=0.038），分别为10.2个月和5.2个月。miR-200a化疗后表达变化显著影响患者PFS（P=0.009），化疗后表达升高组PFS和降低组分别为10.3个月和5.2个月。化疗后miR-200a表达升高者可能与化疗后间质性质的癌细胞死亡相关，从而出现很好的疗效及生存获益率。

表4 复发转移性乳腺癌患者临床病理特征与患者化疗疗效及生存时间的相关性的P P值

综上所述，复发转移性乳腺癌血浆miRNA化疗前、后表达水平对复发转移性乳腺癌患者临床病理特征、化疗疗效及预后有一定预测价值。本实验提示血浆中的miRNA可能为复发转移性乳腺癌的诊断和治疗开辟了一类新的血液肿瘤标志物，有助于判断复发转移性乳腺癌临床病理特征、疗效及预后，更加准确的结果还需进一步扩大样本量及进行前瞻性的研究来证实。

［1］Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2015[J].CA Cancer JClin,2015,65(1):5-29.

［2］Brenner H,Gondos A,Arndt V.Recent major progress in long-term cancer patient survival disclosed by modeled period analysis[J].J Clin Oncol,2007,25(22):3274-3280.

［3］Telli ML,Carlson RW.First-line chemotherapy for metastatic breast cancer[J].Clin Breast Cancer,2009,9(2 Suppl):S66-72.

［4］Lawrie CH,Gal S,Dunlop HM,et al.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma[J].Br J Haematol,2008,141(5):672-675.

［5］Gilad S,Meiri E,Yogev Y,et al.Serum microRNAs are promising novel biomarkers[J].PLoS One,2008,3(9):e3148.

［6］Chen X,Ba Y,Ma L,et al.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J].Cell Res,2008,18(10):997-1006.

［7］Mitchell PS,Parkin RK,Kroh EM,et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(30):10513-10518.

［8］Zhu J,Zheng Z,Wang J,et al.Different miRNA expression profiles between human breast cancer tumors and serum[J].Front Genet,2014,5:149.

［9］李振凤,葛银林,张金玉,等.血浆microRNA在早期乳腺癌诊断中的价值[J].现代生物学进展,2013,13(27):5310-5314.

［10］Anfossi S,Giordano A,Gao H,et al.High serum miR-19a levels are associated with inflammatory breast cancer and are predictive of favorable clinical outcome in patients with metastatic HER2+inflammatory breast cancer[J].PLoS One,2014,9(1):e83113.

［11］Hunter MP,Ismail N,Zhang X,et al.Detection of microRNA expression in human peripheral blood microvesicles[J].PLoSOne,2008,3(11):e3694.

［12］Taylor DD,Gercel-Taylor C.MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer[J].Gynecol Oncol,2008,110(1):13-21.

［13］Kosaka N,Iguchi H,Ochiya T.Circulating microRNA in body fluid:a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis[J].Cancer Sci,2010,101(10):2087-2092.

［14］Wang J,Zhang KY,Liu SM,et al.Tumor-associated circulating microRNAs as biomarkers of cancer[J].Molecules,2014,19(2):1912-1938.

［15］Zhu W,Qin W,Atasoy U,et al.Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects[J].BMC Res Notes,2009,2:89.

［16］Blenkiron C,Goldstein LD,Thorne NP,et al.MicroRNA expression profiling of human breast cancer identifies new markers of tumor subtype[J].Genome Biol,2007,8(10):R214.

［17］Lowery AJ,Miller N,Devaney A,et al.MicroRNA signatures predict oestrogen receptor,progesterone receptor and HER2/neu receptor status in breast cancer[J].Breast Cancer Res,2009,11(3):R27.

［18］Zheng D,Haddadin S,Wang Y,et al.Plasma microRNAs as novel biomarkers for early detection of lung cancer[J].Int JClin Exp Pathol,2011,4(6):575-586.

［19］Hu Z,Chen X,Zhao Y,et al.Serum microRNA signatures identified in a genome-wide serum microRNA expression profiling predict survival of non-small-cell lung cancer[J].JClin Oncol,2010,28(10):1721-1726.

［20］Leidner RS,Li L,Thompson CL.Dampening enthusiasm for circulating microRNA in breast cancer[J].PLoS One,2013,8(3):e57841.

［21］Pritchard CC,Kroh E,Wood B,et al.Blood cell origin of circulating microRNAs:a cautionary note for cancer biomarker studies[J].Cancer Prev Res(Phila),2012,5(3):492-497.

［22］Wang H,Tan G,Dong L,et al.Circulating miR-125b as a marker predicting chemoresistance in breast cancer[J].PLoSOne,2012,7(4):e34210.

［23］Calin GA,Cimmino A,Fabbri M,et al.miR-15a and miR-16-1 cluster functions in human leukemia[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(13):5166-5171.

［24］Kaddar T,Chien WW,Bertrand Y,et al.Prognostic value of miR-16 expression in childhood acute lymphoblastic leukemia relationships to normal and malignant lymphocyte proliferation[J].Leuk Res,2009,33(9):1217-1223.

［25］Bandi N,Zbinden S,Gugger M,et al.miR-15a and miR-16 are implicated in cell cycle regulation in a Rbdependent manner and are frequently deleted or downregulated in non-small cell lung cancer[J].Cancer Res,2009,69(13):5553-5559.

［26］Bonci D,Coppola V,Musumeci M,et al.The miR-15amiR-16-1 cluster controls prostate cancer by targeting multiple oncogenic activities[J].Nat Med,2008,14(11):1271-1277.

［27］Wang F,Fu XD,Zhou Y,et al.Down-regulation of the cyclin E1 oncogene expression by microRNA-16-1 induces cell cycle arrest in human cancer cells[J].BMB Rep,2009,42(11):725-730.

［28］Cittelly DM,Das PM,Salvo VA,et al.Oncogenic HER2{Delta}16 suppresses miR-15a/16 and deregulates BCL-2 to promote endocrine resistance of breast tumors[J].Carcinogenesis,2010,31(12):2049-2057.

［29］Bandres E,Bitarte N,Arias F,et al.MicroRNA-451 regulates macrophage migration inhibitory factor production and proliferation of gastrointestinal cancer cells[J].Clin Cancer Res,2009,15(7):2281-2290.

［30］Hui AB,Lenarduzzi M,Krushel T,et al.Comprehensive microRNA profiling for head and neck squamous cell carcinomas[J].Clin Cancer Res,2010,16(4):1129-1139.

［31］Bergamaschi A,Katzenellenbogen BS.Tamoxifen downregulation of miR-451 increases 14-3-3zeta and promotes breast cancer cell survival and endocrine resistance[J].Oncogene,2012,31(1):39-47.

［32］Lowery AJ,Miller N,Devaney A,et al.MicroRNA signatures predict oestrogen receptor,progesterone receptor and HER2/neu receptor status in breast cancer[J].Breast Cancer Res,2009,11(3):R27.

［33］Zhu H,Wu H,Liu X,et al.Role of microRNA miR-27a and miR-451 in the regulation of MDR1/P-glycoprotein expression in human cancer cells[J].Biochem Pharmacol,2008,76(5):582-588.

［34］Sun L,Yao Y,Liu B,et al.miR-200b and miR-15b regulate chemotherapy-induced epithelial-mesenchymal transition in human tongue cancer cells by targeting BMI1[J].Oncogene,2012,31(4):432-445.

［35］Thiery JP,Acloque H,Huang RY,et al.Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease[J].Cell,2009,139(5):871-890.

［36］Mani SA,Guo W,Liao MJ,et al.The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells[J].Cell,2008,133(4):704-715.

［37］Ward A,Balwierz A,Zhang JD,et al.Re-expression of microRNA-375 reverses both tamoxifen resistance and accompanying EMT-like properties in breast cancer[J].Oncogene,2013,32(9):1173-1182.

［38］Hurteau GJ,Carlson JA,Spivack SD,et al.Overexpression of the microRNA hsa-miR-200c leads to reduced expression of transcription factor 8 and increased expression of E-cadherin[J].Cancer Res,2007,67(17):7972-7976.

［39］Park SM,Gaur AB,Lengyel E,et al.The miR-200 family determines the epithelial phenotype of cancer cells by targeting the E-cadherin repressors ZEB1 and ZEB2[J].Genes Dev,2008,22(7):894-907.

［40］Hu X,Macdonald DM,Huettner PC,et al.A miR-200 microRNA cluster as prognostic marker in advanced ovarian cancer[J].Gynecol Oncol,2009,114(3):457-464.

［41］Yu SJ,Hu JY,Kuang XY,et al.MicroRNA-200a promotes anoikis resistance and metastasis by targeting YAP1 in human breast cancer[J].Clin Cancer Res,2013,19(6):1389-1399.

［42］Castilla MÁ,Díaz-Martín J,Sarrió DC,et al.MicroRNA-200 family modulation in distinct breast cancer phenotypes[J].PLoSOne,2012,7(10):e47709.