BRCA 1、BRCA 2基因突变与乳腺癌风险预测及治疗△

刘笑然 李惠平

北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所乳腺肿瘤内科，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京100142

乳腺癌发病率在我国呈逐年上升的趋势，严重威胁着女性健康。20世纪90年代，学者们首次发现BRCA1和BRCA2基因（BRCA1/2）突变与乳腺癌发生密切相关，但其作用机制始终存在争议[1]。随着研究技术和成果的不断深化，学者们对BRCA1/2基因突变与肿瘤发生的关系逐渐形成共识，BRCA1/2蛋白在细胞分裂过程中对染色体结构和基因序列的完整性起到监护作用，从而预防肿瘤的发生。本文就此作一综述。

1 BRCA 1.2在DNA修复中的作用

1.1 BRCA1.2与DNA忠实性修复

早先的研究发现[2]，小鼠祖系BRCA1/2基因（germline BRCA1/2）拷贝数变异，可引发早期胚胎发育阻滞，同时胚胎细胞对DNA诱变剂的敏感性增强[3]。当细胞基因组受到DNA诱变剂攻击后，BRCA1/2蛋白转运至细胞核内，与其他DNA损伤修复蛋白形成复合体，共同定位于损伤处[4]。BRCA2缺失的细胞会在增殖过程中自发地累积染色体结构损伤，最终导致姐妹染色单体、三倍体及四倍体的形成。同时，BRCA2缺失还导致染色体分离过程紊乱，造成细胞分裂时染色体数目的异常。此外，在BRCA1/2缺失的细胞中，多数非同源染色体上的基因常发生易位、大片段缺失及融合[5]。这些结果提示，在细胞分裂时，BRCA1/2蛋白是维护染色体完整性的重要因子。

BRCA1/2缺失的细胞在有丝分裂过程中会自发地累积各种类型的突变，如DNA双链断裂（double-strand DNA break，DSB）和 子 链 缺 口（daughter-strand gaps，DSG）[6]。同源 DNA 重组（homologous DNA recombination，HR）是 DNA 忠实性修复的一种重要手段，即通过同源重组的方法，用正确的同源等位DNA片段纠正发生突变的DNA片段。在正常细胞分裂过程中，模板链上出现损伤会导致DNA复制叉运行停滞，然后细胞将错误的DNA片段切断以引发DSB并启动HR修复。有时DNA复制也可先行绕过复制叉停滞点，暂时保留DNA损伤点并形成DSG，而DSG同样可以启动HR修复。BRCA1/2是哺乳动物细胞启动HR修复不可或缺的因子，当BRCA1/2缺失时，DNA损伤会引发非忠实性修复，如非同源末端链接修复（nonhomologous end joining，NHEJ）或微同源末端链接修复（microhomology-mediated end joining，MHEJ）[7-8]。这两种机制可使DNA断裂处快速连接，但无法确保子链与模板链序列的一致性，因此，会增加基因突变的风险。

1.2 BRCA1.2在HRHR修复中的功能

在HR修复过程中，BRCA1/2蛋白通常被它们的伴侣蛋白PALB2桥接在一起[9]，但BRCA1/2发挥的功能不尽相同[10]。普遍观点认为，BRCA1负责在DNA损伤的初步阶段发出损伤信号并启动HR修复；BRCA2则负责稳定基因组复制过程中的DNA损伤区域，并招募关键性重组酶RAD51直接参与HR的修复过程[11]。

BRCA1蛋白通过C末端的BRCT结构域定位到DNA的损伤位点并发挥功能[12]。其具体过程为：DNA发生损伤后，RAP80蛋白与DNA损伤处的泛素蛋白结合；与此同时，DNA损伤信号诱导桥接蛋白Abraxas的磷酸化，而BRCA1通过BRCT结构域识别并结合磷酸化的Abraxas，磷酸化的Abraxas再与RAP80蛋白发生桥接，最终形成BRCA1-Abraxas-RAP80 复 合 物[13]。 此 外 ，BRCA1还可以结合DNA解旋酶BRIP1[14]或DNA修复酶CtIP[15]，从而形成多种复合物。可以说，HR修复过程中，BRCT结构域是决定BRCA1功能的重要结构[16]。当细胞周期在G1期时，53BP1蛋白会结合到DNA损伤的末端，同时招募其他因子以防止细胞进行HR修复。进入G2期后，含有BRCA1的大分子复合物通过一种未知的机制将53BP1蛋白移除，随后5'→3'核酸内切酶对DSB位点进行剪切修饰，暴露出具有3'游离末端的单链DNA（single stranded DNA，ssDNA）作为HR修复的起始底物。此外，BRCA1还负责将细胞阻滞在G2期，为HR修复提供足够的时间[17-18]。DNA修复酶CtIP与53BP1竞争性结合BRCA1的BRCT结构域，并参与HR修复过程中同源基因片段的置换[19]。转基因小鼠模型的实验[20]证明，CtIP与BRCA1的结合是HR修复、DNA损伤应答所必需的。

在剪切修饰后，DSB位点上大量的ssDNA结合蛋白RPA（replication protein A）被移除并形成裸露的ssDNA。这种移除功能正是由BRCA2来实现的。BRCA2与DSS1酸性蛋白结合以后，会形成一个含有寡聚核苷酸-寡聚糖重复域及DNA结合域的复合物——BRCA2-DSS1。BRCA2-DSS1能够靶向结合DSB和DSG位点并移除RPA，为后续的重组酶RAD51介入提供先决条件[21]。RAD51在损伤位点上与ssDNA形成一个细丝状的核蛋白复合物——RAD51-ssDNA；随后，RAD51-ssDNA启动同源等位基因的联会及置换，完成HR修复。需要指出的是，在体内正常的环境下，RAD51倾向与双链DNA（double strand DNA，dsDNA）形成稳定的复合体，而不是ssDNA。BRCA2通过其BRC结构域与RAD51结合后，可调节RAD51对底物DNA的选择性，克服RAD51对dsDNA结合的偏好性。BRC结构域由8个含有30～40个氨基酸基序的单位重复排列形成，并且在所有哺乳动物的同源蛋白中高度保守[22]。BRCA2与RAD51结合后会稳定RAD51-ssDNA丝状复合物[23]，同时还抑制RAD51与dsDNA的结合[24]。这种倾向性极强的调控确保了RAD51-ssDNA的稳定性，使HR修复中的同源DNA置换环节顺利进行[25]。研究发现[26]，BRCA2缺失的细胞长期暴露于羟基脲（dNTP类似物）中，其基因组出现大量停滞的DNA复制叉，并在停滞的部位频发DSB。这说明BRCA2可以稳定复制叉停滞部位的DNA结构，防止DSB的发生。此外，BRCA2的C末端结构域在HR修复过程中，还保护DNA损伤位点上的ssDNA不受MRE11核酸酶的降解[27]。

2 BRCA 1.2突变与乳腺癌风险

2.1 B RCA 1.2突变增加了乳腺癌发生的风险

迄今为止，分别在人类BRCA1和BRCA2基因中发现了1800个和2000个突变，其类型包括：内含子突变、错义突变、读码框插入或缺失突变（breast cancer information core；www.research.nhgri.nih.gov/bic）。在BRCA1蛋白中，高致病性（highly penetrant）的错义突变通常会发生在RING及BRCT结构域中[28]，这些都是BRCA1进行DNA修复的关键结构域。在BRCA2蛋白中，高致病性的错义突变通常发生在DNA结合域上[29]。在BRCA1中，有14%的突变由基因重排所致，而在BRCA2中的突变率约为2.6%，其中大量的重复Alu残基是易引起基因重排的因素之一[30]。近来，一些研究开始关注BRCA1/2在特定人群中的“始祖突变”（founder mutation），如阿什克纳齐（德系）犹太人的群体中，约有3%的人携带三种始祖突变，分别是BRCA1基因中的185delAG（约占1%）和5382insC（约占0.13%），以及BRCA2基因中的6174delT（约占1.52%）[31]。另外，在西班牙裔人群中，BRCA1基因发生ex9-12del突变的发生率约为10%[32]；在荷兰裔人群中，也存在导致BRCA1基因删除和缺失的始祖突变[33]。因此，在进行BRCA1/2突变筛查时，有必要根据患者所属人种及其始祖突变进行有针对性的初筛。

流行病学调查显示，在乳腺癌及卵巢癌中，遗传性突变的致癌率要显著高于始祖突变的致癌率[34]。在欧美人群中，BRCA1基因突变携带者在70岁时罹患乳腺癌和卵巢癌的概率分别约为57%及40%，而BRCA2基因突变的携带者其发病概率分别是49%及18%[35]。乳腺癌与卵巢癌患病概率的差异，一部分是由于个体间生活环境的不同，另一部分则是因为BRCA1/2突变发生位点及类型的不同，如在卵巢癌中，位于BRCA1/2基因中间区域的“卵巢癌簇区域”（ovarian cancer cluster regions，OCCR）是突变的高发区，经常出现无义突变和移码突变。与位于BRCA1/2基因两端区域的突变相比，OCCR突变导致卵巢癌的风险更高[36]。通过对19 581例BRCA1突变携带者和11 900例BRCA2突变携带者进行筛查的研究证实，在BRCA1/2基因的中心区域发生突变时，发生卵巢癌的风险会增高，而发生乳腺癌的风险降低；相反，在BRCA1/2基因的两端区域发生突变时，乳腺癌的发病风险将提高[36]。通过全基因组水平分析，研究者认为造成乳腺癌及卵巢癌发病风险差异的部分原因是患者还存在除BRCA1/2基因突变以外的其他基因组学修饰差异[37]。如果考虑到这些基因组学修饰的影响，那么BRCA1突变的携带者，其80岁时患乳腺癌的概率约为81%，患卵巢癌的概率不低于63%；而BRCA2突变的携带者在80岁时罹患乳腺癌的概率为83%[37]。

2.2 BRCA 1.2基因突变的国内研究进展

在国内，研究热点主要集中于乳腺癌家族遗传性BRCA1/2基因突变。研究显示[38]，中国人约有12.9%的家族遗传性乳腺癌患者携带BRCA1/2致病性突变。北京大学肿瘤医院谢云涛研究小组采用聚合酶链式反应直接测序法，对409例家族遗传性乳腺癌患者的BRCA1/2基因进行了全外显子突变检测[39]。结果发现，所有患者的BRCA1/2致病性突变率为10.5%，其中年龄小于40岁的患者突变率达到23.0%。此外，ER、PR及HER2受体表达均为阴性的患者BRCA1/2基因致病性突变率为20.8%[40]。值得注意的是，在筛查出的突变位点中，约有50%的突变属首次报道，提示可能为中国人群特有的“始祖突变”。与欧美筛查结果不同的是，中国人的BRCA2基因突变率高于BRCA1，而白种人的BRCA1突变较为常见[41]。上述结果表明，在乳腺癌易感基因筛查时不仅要考虑突变位点对风险评估的影响，更要考虑目标人群的人种因素。因此，应通过扩大筛查量并建立突变文库，以逐渐摸索出一套适用于中国人群BRCA1/2基因突变的检测标准和体系。

3 BRCA 1.2突变与临床治疗策略的关系

3.1 BRCA 1.2突变与乳腺癌诊疗选择

目前，有几种以BRCA1/2突变为靶点的临床诊疗策略，可降低女性罹患乳腺癌的风险及死亡率。分别是：①早期影像学筛查；②预防性乳房切除术（risk-reducing mastectomy，RRM）和（或）预防性输卵管-卵巢切除术（risk-reducing salpingo-oophorectomy，RRSO）；③靶向化疗。

研究发现[42]对于BRCA1/2遗传性突变的乳腺癌患者而言，乳腺钼靶的早期筛查存在局限性（新发肿瘤的漏查率约为29%），确诊时肿瘤已经生长至一定程度，其中1/3还伴有淋巴结转移。其中部分原因是由于BRCA1/2遗传性突变多发于恶性程度高、生长迅速的“三阴性”乳腺癌[43]。相反，利用磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）技术，医生们检出BRCA1/2突变携带者的数量是钼靶及超声检查的两倍[42]，并发现了约10%的早期乳腺癌。目前，MRI已经作为筛查BRCA1/2突变的推荐检测项目之一。当然，检测精确度的提高也伴随着假阳性率的升高。研究显示[42]，MRI结合钼靶检查的误诊率约为11%，而单独使用钼靶的误诊率只有5%。

在手术干预方面，尽管RRM使遗传性BRCA1/2基因突变者的乳腺癌患病风险降低了90%[44]，但由于MRI早期诊断的敏感性高，约64%的美国女性及78%的加拿大女性都选择不采取RRM干预[45]。相反，由于血清中的检测指标敏感性和特异性差，RRSO正逐渐成为遗传性BRCA1/2基因突变的卵巢癌患者的首选治疗方案[46]。研究证实RRSO可以极大地降低（80%～90%）遗传性BRCA1/2基因突变者罹患女性生殖系统肿瘤的风险[47]，使乳腺癌的发病风险降低了约50%，其原因可能是RRSO造成了绝经状态提前[48]。不仅如此，RRSO还使遗传性BRCA1/2基因突变的女性乳腺癌患者总体死亡率降低了60%。总而言之，BRCA1/2基因突变检查联合RRSO的治疗策略，为基因水平的“个体化治疗”提供了一个很好的范例[49]。

3.2 BRCA 1.2基因突变与化疗

化疗干预也与BRCA1/2基因突变检查建立了紧密的联系。希望保乳的乳腺癌高危女性患者，可通过抗雌激素治疗降低原发性乳腺癌的风险，如他莫昔芬可以使BRCA1/2基因突变者罹患乳腺癌的风险降低40%～50%[50]。但是有报道提出，口服避孕药5年以上会使BRCA1/2基因突变者罹患乳腺癌的风险提高30%～50%[51]。体内外及临床试验证明，铂类药物是BRCA1/2基因突变肿瘤患者的理想选择，其原理是铂类药物可引起DNA链之间的交联，而这种损伤只能通过BRCA1/2蛋白介导的HR修复解除[52]。

3.3 BRCA 1.2基因突变与靶向治疗

BRCA1/2基因突变的细胞还对多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］抑制剂敏感。PARP是一种参与碱基剔除修复的关键酶[53]，在BRCA1/2突变的细胞中，HR修复如果没有PARP酶的参与，细胞的染色体将变得极其不稳定，进而导致细胞周期阻滞及凋亡[54]。临床试验已经证实了PARP1抑制剂（PARP1i）在有BRCA1/2基因突变的肿瘤（如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌及前列腺癌等）中的效果。目前，在四种备选的PARP1i药物中，有一种已于2014年进入了Ⅱ期临床阶段，预计将很快得到批准并投放市场[55]。

3.4 PARPPARP11i i在治疗BRCA1.2基因突变乳腺癌中存在的问题

对目前极具临床潜力的PARP1i药物也不能盲目乐观[56-57]，其中有几个问题值得深思：①小鼠实验证明[58]，BRCA1蛋白N末端的BARD1结构域会发生一种常见的突变［p.Cys61Gly（c61G）］，该突变未能增强肿瘤细胞对PARP1i的敏感性。这就需要明确与PARP1i敏感性相关的BRCA1/2基因突变位点，精确定位获益人群。②部分肿瘤中的BRCA1/2基因为杂合突变，因此，细胞仍具有合成正常BRCA1/2蛋白的能力，这类患者很可能无法从PARP1i中获益。③由于BRCA1/2基因突变的细胞染色体不稳定，极易发生基因二次突变，赋予细胞新的耐药特性，尤其是在一些有铂类药物治疗史的患者中，BRCA1/2的功能随着药物使用时间的推移，会出现一定程度的恢复[59]。④当患者的正常细胞携带有BRCA1/2基因杂合突变时，PARP1i与蒽环类药物或抗代谢药物联合应用会引起明显的药物不良反应。体外实验发现[60]，携带BRCA1/2基因杂合突变的非肿瘤细胞在接受PARP1i处理时，DNA损伤标志因子γH2AX与PARP1i呈剂量依赖关系。因此，优化PARP1i的临床治疗方案很必要，如探索PARP1i的最佳暴露剂量或者设法提高药物靶向作用的精确性。

4 展望

过去的20年中，学者们在研究BRCA1/2基因的功能方面屡获硕果，并认识到在细胞周期活动中，由于BRCA1/2蛋白的参与，极大地降低了肿瘤发生的风险。这些研究逐渐形成一整套成熟的科研体系，不但揭示了染色体不稳定性诱导细胞癌变的机制，还将BRCA1/2基因突变应用于临床肿瘤风险预测中，并以BRCA1/2基因突变为靶点研发出新的药物及临床诊疗策略。相信随着基因组学、蛋白质组学和生物信息学等高通量检测分析技术的发展，乳腺癌“基因个体化治疗”策略会愈加完善，使更多的患者受益。

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