肿瘤放射治疗生物学效应研究进展

胡乐林 王俊杰

北京大学第三医院肿瘤治疗中心，北京100083

肿瘤放射治疗生物学效应研究进展

胡乐林 王俊杰#

北京大学第三医院肿瘤治疗中心，北京100083

放射治疗是一种重要的肿瘤治疗方式，传统观点认为射线主要通过DNA损伤活化损伤感应器触发细胞凋亡、坏死、有丝分裂殇折或细胞衰老而发挥抗肿瘤的功能。研究证实，射线除了损伤DNA还作用于细胞质膜和亚细胞器通过细胞内的多条信号途径调节细胞凋亡，增殖分化和迁移，并且射线照射细胞也能向邻近未被照射的肿瘤细胞传递旁观者应答信号杀伤邻近肿瘤细胞，保护正常组织免受破坏。本文主要就肿瘤放射治疗过程中这些生物学效应展开综述，为明确肿瘤细胞对射线的应答信号通路打下基础，并有助于开发新的放疗增敏剂。

放射治疗；DNA损伤；神经酰胺；旁效应

自从1895年射线被发现以来，放射治疗在许多恶性肿瘤一线治疗中发挥重要作用。细胞生物学和分子生物学的发展增加了人们对放射治疗后细胞应答效应的理解。射线一方面对DNA、质膜和亚细胞器靶向损伤通过多种蛋白信号传递途径触发被照射的细胞死亡，另一方面被照射细胞向邻近未被照射的肿瘤细胞传递旁观者应答信号杀伤邻近肿瘤细胞，保护正常组织免受破坏[1]。

1 DNA的损伤

DNA是射线最重要的生物效应靶点，射线引起的DNA永久性损伤程度与细胞死亡密切相关。射线直接损伤DNA或者通过活性氧（ROS）/活性氮（RNS）对DNA产生间接损伤。平均每个细胞接受每Gy的射线能产生105的电离作用，除了其他类型的DNA损伤外能引起2000个单链断裂和40个双链断裂。射线照射后通过DNA损伤感应器和细胞周期调节器传递信号[2]。

DNA损伤的感应和应答对保持肿瘤细胞的稳态预防肿瘤的发展至关重要。细胞对DNA损伤的应答分为三部分：DNA损伤的感应阶段，DNA损伤信号通路的活化阶段，DNA损伤的修复阶段。在这三个阶段中的相关蛋白行使DNA损伤的感应器，传导器和效应器[3]。如果DNA损伤被有效地修复，细胞恢复正常功能；如果损伤不能被完全修复，慢性DNA损伤将触发细胞凋亡或细胞衰老而发挥抗肿瘤的功能[4]。

2 细胞膜损伤

以往的研究认为细胞核中DNA双螺旋是射线直接能量沉积或者间接通过ROS/RNS作用的主要靶点。利用微光束系统选择照射无核的鞘脂类神经酰胺膜证实除DNA外质膜是射线诱导的细胞应答另一个目标。射线诱导产生大量的ROS/RNS，ROS/RNS主要是通过脂质过氧化物反应、鞘脂类神经酰胺的产生、细胞内Ca2+水平的改变影响细胞内的多条信号通路调节细胞多种功能，如凋亡、增殖分化、迁移、细胞骨架和形态的改变[2]。

2.1 射线对质膜的损伤

在暴露于射线情况下氧化损伤是射线诱导细胞死亡的重要机制，射线刺激ROS/RNS的产生，ROS/RNS是胞质信号传导中的重要活化剂。一方面，射线直接或通过ROS/RNS间接活化质膜的鞘磷脂酶，脂质降解直接影响质膜的流动性和渗透性。这种降解影响大多数多不饱和脂肪酸，导致他们的极性组件破碎，随之缺少膜屏障的功能，而这种膜屏障功能对肿瘤细胞的完整性至关重要[5]。另一方面，射线和氧化应激情况下膜鞘磷脂被鞘磷脂酶水解导致神经酰胺在原位产生，神经酰胺诱导膜微域聚集形成富含神经酰胺的平台，死亡受体(Trail,CD95,TNF)，Toll样受体(TLR2,4,5)，细胞因子受体IL-1R能够聚集于这些神经酰胺富集的平台在膜的小区域形成高密度受体，受体聚集限制横向扩散稳定受体和配体的相互作用[6]。

2.2 质膜相关信号分子和第二信使

在射线诱导的膜信号通路中神经酰胺途径至关重要。神经酰胺如同磷酸二醇和甘油三酯一样在凋亡信号中作为第二信使在质膜外侧重组并缓慢向脂质双层内侧翻转，从而能与细胞内的分子相互作用。研究显示，丝氨酸和苏氨酸磷酸化酶是神经酰胺的效应分子，能与神经酰胺的特异结合。这些磷酸酶能活化不同的信号蛋白，如Rb，Bcl-2，c-jun，蛋白激酶Cα(PKCα)，PKCζ等[7]。研究证实质膜通道是神经酰胺的新靶点。例如在T淋巴细胞神经酰胺抑制钙流入的钙通道和电压门控的钾通道，引起钾流出[8-9]。最近的研究还证实。钙和Rho蛋白有可能也在射线诱导的膜信号通路中起重要作用[10-11]。

3 亚细胞器的损伤

射线照射后引起亚细胞器如内质网、线粒体的靶向损伤可能在射线引起的效应中也起着重要的作用。射线引起内质网应激诱导多种细胞的非折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）。非折叠蛋白反应有利于恢复内质网的稳态并降解错误折叠的蛋白从而增加细胞的蛋白折叠能力。非折叠蛋白反应转录活化Grp78。它包括三部分IRE1(inositol-requiring enzyme 1)，PERK(protein kinase RNA-like ER kinase)，ATF6(activating transcription factor 6)。内质网应激应答中IRE1，PERK和ATF6促进内质网稳态重建基因的表达从而始动内质网应激信号传导。当内质网应激延长或过度时，这些非折叠蛋白反应将引起应激细胞的死亡。最近的研究显示，射线应答中非折叠蛋白反应中PERK/eIF2α（eukaryotic translation initiation factor 2α）能够调节乳腺癌的放射敏感性[12]。除内质网外线粒体也在射线作用的重要靶点，射线通过释放ROS的直接应答或改变线粒体膜通透性间接触发的细胞色素C的释放而启动凋亡[13]。

有研究显示，射线照射细胞的胞质提取物能够诱导正常核的DNA片段化，并且直接照射细胞胞质也能引起细胞死亡和基因突变。因此，胞质也是射线基因毒效应的重要靶标[14]。Shao等认为低剂量射线照射后不仅直接DNA损伤来启动重要的细胞信号，整个细胞被认为射线照射的感应器[15]。

4 细胞旁效应

早在1953年Mole提出射线诱导的远位效应，他将这种效应定义为放射对机体远离射线照射区的作用效应[16]。40年后Nagasawa和Little等[17]在体外描述射线照射后射线直接照射的细胞对邻近非照射细胞的基因毒效应。研究证实，当单层培养中国仓鼠卵巢癌细胞暴露于低剂量α粒子，不到1%的细胞核被单α粒子穿透，但是有30%的细胞姐妹染色单体交叉，这种效应被定义为射线引起的旁效应，它主要由非照射细胞对直接照射细胞释放信号的应答，这些非照射细胞将射线对直接照射细胞的生物学效应扩大[18]，在体外使用培养的多种细胞，组织外移植，组织模型的3D重建以及在体内使用鱼和龋齿动物模型证实旁效应的存在。旁效应包括一系列生物程序，如DNA损伤、恶性转化、染色体畸变、细胞死亡、凋亡和放射适应性应答。在这个程序中多种致染色体畸变因子和信号传导分子参与其中[19]。

4.1 细胞间缝隙连接传递信号

当细胞或组织暴露于射线时除了对DNA损伤的直接应答，细胞通过细胞间缝隙连接和炎症应答传递信号。缝隙连接是一种细胞间多亚基蛋白组成的通道，这种通道允许1000～1500 Da的信号分子通过，从而使直接接触的细胞间的效应信号得以传导。一些重要的和代谢分子通过细胞缝隙连接功能（gap junctional intercellular communication，GJIC）传送，包括Ca2+、核苷酸、肽和第二信使[20]。

4.2 释放炎症介质传递信号

旁效应应答的第二条途径是受照射的细胞通过释放可溶性因子介导。这些因子能通过培养基从照射细胞向非照射细胞传递[21]。这些因子被广泛研究，它们的分子量大小从1000到10000 kDa，包括脂类过氧化物、肌酐和细胞因子，如肿瘤坏死因子α（TNFα）。1922年第一篇有关射线照射后引起可溶性因子释放的研究被报道。用射线照射动物的血清刺激悬浮淋巴细胞生长，这种效应在射线照射后1～2 h比较明显，而在17 h后观察不到[22]。在1950～1960年的进一步研究证实放射治疗患者的血液标本中含有致染色体断裂的因子。多种因子在切尔诺贝利核电事故后暴露于射线的人的血标本中被报道[23]。一系列研究证实细胞因子包括IL-6，IL-8，TGFβ1，TNFα，ROS和RNS在放射引起的旁效应中起重要作用[24]。旁效应介导的信号应答与炎症应答有许多相似之处。例如：最近的研究显示，射线照射也能引起体内巨噬细胞发生持续性高水平的氧化应激[25]。

5 结语

过去几十年肿瘤分子生物学技术的发展为其在临床中的应用打下基础。以信号传导途径为靶点的药物治疗有希望与放疗联合增强放疗的疗效。这些靶向药物通过特异的活化或者抑制某些分子靶点来调控放射应答。但是，在临床实践中放射治疗与分子治疗相结合才起步。如果要发展潜在的治疗靶点就必须深入研究肿瘤放射治疗的效应机制。射线主要通过损伤DNA，细胞质膜，亚细胞器或者通过旁效应应答作用活化多条信号途径调节细胞凋亡、增殖分化、迁移等多种功能。肿瘤细胞对射线的应答机制以及这些细胞中的信号通路的阐明，有助于开发新药增加放射杀伤肿瘤细胞的能力，并保护正常组织免受更多的破坏。

［1］Marin A,Martin M,Linan O,et al.Bystander effects and radiotherapy[J].Rep Pract Oncol Radiother,2015, 20(1):12-21.

［2］Lewanski CR,Gullick WJ.Radiotherapy and cellular signalling[J].Lancet Oncol,2001,2(6):366-370.

［3］Jackson SP.Detecting,signalling and repairing DNA double-strand breaks[J].Biochem Soc Trans,2001,29(Pt6): 655-661.

［4］Villanueva MT.DNA repair:A new tool to target DNA repair[J].Nat Rev Cancer,2015,15(3):136.

［5］Edimecheva IP,Kisel MA,Shadyro OI,et al.The damage to phospholipids caused by free radical attack on glycerol and sphingosine backbone[J].Int JRadiat Biol, 1997,71(5):555-560.

［6］Aureli M,Murdica V,Loberto N.Exploring the link between ceramide and ionizing radiation[J].Glycoconj J, 2014,31(6-7):449-459.

［7］Hirai T,Chida K.Protein kinase Czeta(PKCzeta):activation mechanisms and cellular functions[J].J Biochem, 2003,133(1):1-7.

［8］Church LD,Gabriele H,Goodall JE,et al.TNFR1-induced sphingomyelinase activation modulates TCR signaling by impairing store-operated Ca2+influx[J].JLeukoc Biol,2005,78(1):266-278.

［9］Szabo I,Gulbins E,Apfel H,et al.Tyrosine phosphorylation-dependent suppression of a voltage-gated K+channel in T lymphocytes upon Fas stimulation[J].J Biol Chem,1996,271(34):20465-20469.

［10］Gupta N,Nodzenski E,Khodarev NN,et al.Angiostatin effects on endothelial cellsmediated by ceramide and RhoA[J].EMBO Rep,2001,2(6):536-540.

［11］Pozo MAD,A lderson NB,Kiosses WB,et al.Integrins regulate Rac targeting by internalization of membrane domains[J].Science,2004,303(5659):839-842.

［12］Lee ES,Lee HJ,Lee YJ,et al.Chem ical chaperones reduce ionizing radiation-induced endoplasmic reticulum stress and cell death in IEC-6 cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,450(2):1005-1009.

［13］Kam WY,Banati RB.Effects of ionizing radiation on mitochondria[J].Free Radic Biol Med,2013,65(4): 607-619.

［14］Hamada N,Maeda M,Otsuka K,et al.Signaling pathways underpinning themanifestations of ionizing radiation-induced bystander effects[J].Curr Mol Pharmacol, 2011,4(2):79-95.

［15］Shao C,Folkard M,M ichael BD,et al.Targeted cytoplasmic irradiation induces bystander responses[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(37):13495-13500.

［16］Mole RH.Whole body irradiation;radiobiology ormedicine?[J].Br JRadiol,1953,26(305):234-241.

［17］Nagasawa H,Little JB.Induction of sister chromatid exchanges by extremely low doses of alpha-particles[J].Cancer Res,1992,52(22):6394-6396.

［18］Azzam EI,de Toledo SM,Little JB.Stress signaling from irradiated to non-irradiated cells[J].Curr Cancer Drug Targets,2004,4(1):53-64.

［19］Havaki S,Kotsinas A,Chronopoulos E,et al.The role of oxidative DNA damage in radiation induced bystander effect[J].Cancer Letters,2015,356(1):43-51.

［20］Oyamada M,Oyamada Y,Takamatsu T.Regulation of connexin expression[J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes,2005,1719(1-2):6-23.

［21］Marín A,Martín M,Liñán O,et al.Bystander effects and radiotherapy[J].Rep Pract Oncol Radiother,2014, 20(1):12-21.

［22］Murphy JB,Liu JH,Sturm E.Studies on X-ray effects: IX.the action of serum from X-rayed animals on lymphoid cells in vitro[J].J Exp Med,1922,35(3):373-384.

［23］Emerit I,Levy A,Cernjavski L,et al.Transferable clastogenic activity in plasma from persons exposed as salvage personnel of the Chernobyl reactor[J].J Cancer Res Clin Oncol,1994,120(9):558-561.

［24］Najafi M,Fardid R,Hadadi G,et al.The mechanisms of radiation-induced bystander effect[J].JBiomed Phys Eng,2014,4(4):163-172.

［25］Coates PJ,Robinson JI,Lorimore SA,et al.Ongoing activation of p53 pathway responses is a long-term consequence of radiation exposure in vivo and associates w ith altered macrophage activities[J].J Pathol,2008, 214(5):610-616.

R730.55

A

10.11877/j.isn.1672-1535.2015.05.05

#通信作者（corresponding author），e-mail：junjiewang_edu@sina.cn

2015-01-05)