蜕膜组织中调节性T 细胞的表达与妊娠期免疫耐受的关系

张一丹

生殖免疫学说认为妊娠的本质可视为成功的半同种移植现象，而孕妇对胚胎半同种抗原的免疫耐受情况与妊娠的成功密切相关［1］。妊娠期免疫耐受的调节涉及复杂的免疫信号网络调节，若某一环节发生障碍均可导致妊娠失败。大量研究发现，CD4+CD25+调节性T（Treg）细胞可通过调控机体传统T 细胞的活化和T 细胞的免疫反应等反应过程进而主动获得和维持自身耐受［2-3］。然而具体分子机制仍尚未完成阐明。近来研究发现，Treg 细胞/辅助性T 细胞17（Th17）的表达失衡及巨噬细胞亚群功能的改变可能与妊娠免疫耐受密切相关。但现阶段，妊娠妇女孕早期Treg 细胞的功能改变是否与原因不明复发性流产（URSA）有关仍需更多证据予以证明。基于此背景，本课题拟以URSA 患者作为研究对象，通过观察对比蜕膜组织Treg 细胞的表达情况，以深入阐明Treg 细胞的表达与妊娠期免疫耐受的关系，从而为后续更进一步的临床研究提供新线索。

1 资料与方法

1.1 一般资料 对深圳市人民医院2019 年5 月至2020 年10 月收治的URSA 患者80 例作为URSA组，50 例正常早孕人工流产终止妊娠的妇女作为对照组。纳入标准：（1）符合中华医学会妇产科分会相关标准［4］；（2）对照组患者均于深圳市人民医院行终止妊娠手术；（3）孕妇无先天性免疫性疾病；（4）孕妇及其家庭自愿参加本次实验。排除标准：（1）2组患者均排除有染色体、内分泌异常者；（2）因外界因素导致流产者；（3）合并有感染者；（4）患者不同意签署知情同意书者；本次研究经院伦理委员会批准。2 组患者年龄、体重指数（body indet，BMI）、孕次等基线资料差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 URSA 组与对照组妊娠妇女一般资料比较

1.2 方法 所有患者均由同一组医师进行妊娠终止手术，并在术中收集2 组患者蜕膜组织，采用缓冲液（LP7）冲洗，除去血凝块后进行过滤，过滤完毕后溶于IMDM 培养液制作成细胞悬液。采用免疫磁珠分离法（MACS）分离纯化巨噬细胞，操作按照试剂说明书进行，试剂购置于：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；采用流式细胞术检查Th17 和CD4+CD25+T 细胞水平，仪器购置于广州朗日生物技术有限公司；采用酶联免疫吸附法检测白细胞介素-17（IL-17）、白细胞介素-23（IL-23）、白细胞介素-10（IL-10）、γ 干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-6（IL-6）、凝血酶敏感蛋白1（TSP1）、转化生长因子-β（TGF-β）、巨噬细胞移动抑制因子（MIF）水平，试剂盒购置于艾维可生物科技有限公司。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0 软件进行数据统计。正态分布的计量资料以±s表示，采用t检验。分类变量采用χ2检验或Fisher 检测。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蜕膜组织中Treg 细胞比例表达 URSA 组Th17 细胞和CD4+CD25-表达水平均显著高于对照组（P＜0.05），而CD4+CD25bringht、CD4+CD25bringht/CD4+表达水平显著低于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 URSA 组与对照组妊娠妇女蜕膜组织中Treg 细胞比例表达（± s）

表2 URSA 组与对照组妊娠妇女蜕膜组织中Treg 细胞比例表达（± s）

注：URSA 为原因不明复发性流产，Th17 为辅助性T 细胞17

组别CD4+CD25bringht CD4+CD25-CD4+CD25bringht/CD4+Th17 细胞（%）URSA 组（n=80）对照组（n=50）t 值P 值0.59±0.13 9.72±1.21 5.26±1.01 7.35±0.27 5.87±0.96 10.64＜0.01 1.24±0.23 18.24＜0.01 7.02±0.81 15.23＜0.01 12.87±2.57 19.99＜0.01

2.2 蜕膜组织中巨噬细胞表面分子表达 URSA组CD36 表达水平均显著高于对照组（P＜0.05），而CD47、TSP1 表达水平显著低于对照组（P＜0.05）。见表3。

表3 URSA 组与对照组妊娠妇女蜕膜组织中巨噬细胞表面分子表达（± s）

表3 URSA 组与对照组妊娠妇女蜕膜组织中巨噬细胞表面分子表达（± s）

注：URSA 为原因不明复发性流产，TSP1 为凝血酶敏感1

组别URSA 组（n=80）对照组（n=50）t 值P 值TSP1 73.54±3.54 88.51±6.55 14.86＜0.01 CD36 21.85±6.57 10.57±2.54 13.79＜0.01 CD47 96.57±10.24 99.63±5.63 2.19 0.03

2.3 Treg 细胞表达的相关性分析 Treg 细胞的表达与IL-17（r=0.54，P＜0.05）、IL-23（r=0.42，P＜0.05）、IL-10（r=-0.47，P＜0.05）、IFN-γ（r=0.51，P＜0.05）、IL-6（r=0.49，P＜0.05）均呈现相关性。见表4。

表4 Treg 细胞表达的相关性分析

2.4 蜕膜组织中相关因子表达比较 URSA 组IL-17、IL-23、IFN-γ、IL-6 表达水平均显著高于对照组（P＜0.05），IL-10 显 著 低 于 对 照 组（P＜0.05），见表5。

表5 URSA 组与对照组妊娠妇女蜕膜组织中相关因子表达比较（± s）

表5 URSA 组与对照组妊娠妇女蜕膜组织中相关因子表达比较（± s）

注：URSA 为原因不明复发性流产，IL-17 为白细胞介素-17，IL-23 为白细胞介素-23，IL-10 为白细胞介素-10，IFN-γ 为γ 干扰素，IL-6 为白细胞介素-6

组别URSA 组（n=80）对照组（n=50）t 值P 值IL-17 47.63±4.32 19.35±2.72 45.80＜0.01 IL-23 27.01±2.61 24.32±2.15 6.38＜0.01 IL-6 37.85±5.42 19.45±3.57 23.33＜0.01 IL-10 22.02±4.03 27.67±3.97 7.85＜0.01 IFN-γ 58.24±12.21 52.18±11.67 2.83＜0.01

3 讨论

URSA 病因复杂，临床发生率约1%～5%。URSA的发生与免疫排斥密切相关。既往研究证实，T细胞在适应性免疫应答中扮演尤为重要的角色，其参与调控免疫防御、监视和介导异体移植物免疫排斥反应等多个细胞功能［6］。研究证实，母胎免疫是唯一与经典免疫学相悖的现象，即妊娠的成功与母亲对胎儿维持持续的免疫耐受有关［7］。有证据表明，母亲与胎儿并无直接接触，而妊娠过程中母亲接收来自于胎盘的丰富的胎盘抗原和胚胎，使母亲天然的耐受型T 细胞免疫反应被激活［8］。调节性T 细胞（Treg）被发现在URSA 患者脱模组织中表达降低，故有观点认为其表达比例失衡与URSA 发生密切相关［9］。然而母亲Treg 的表达失衡及其对妊娠期免疫耐受的调控机制仍未完全阐明，故进一步开展实验以明确其在妊娠期免疫耐受中的作用意义重大。

传统观点认为，Th1/Th2 的动态平衡所维持的免疫稳态是调控妊娠免疫功能的关键因素［10］，而随着Th17 细胞的发现逐渐有观点认为，Treg/Th17 共同介导的免疫调节作用可能远远大于Th1/Th2。重要的是研究发现，在胚胎发育的极早期便能检测到巨噬细胞系的表达［11-12］。巨噬细胞可分为M1 和M2 亚型，其中M1 型可由IFN-γ 或脂多糖（LPS）诱导产生并介导下游炎症因子的激活，而M2 型由IL-10和IL-4 等抗炎因子介导产生，可激发吞噬、清除凋亡细胞，低抗原提呈能力及下调协同刺激分子进而利于妊娠维持［13］。本实验结果显示，URSA 组妇女CD4+CD25bringht、CD4+CD25-、CD4+CD25bringht/CD4+、Th17 细胞及CD36、CD47、TSP1 水平显著低于对照组，表明URSA 患者存在Treg 细胞、Th17 和巨噬细胞的表达紊乱。考虑母-胎免疫耐受与T 细胞功能情况密切相关，Th17/Treg 是除Th1/Th2 外相对独立的细胞因子网络，母-胎界面蜕膜组织中Treg 细胞表达的改变被证实是引发生殖障碍的关键环节［14］。动物实验发现，小鼠Treg 细胞缺失后可显著影响胚胎植入成功率［15］。研究发现，正常机体中Treg 细胞数量表达处于相对优势地位，Th17 的表达被抑制，而当免疫平衡被打破后Th17 的分泌增加并继发表达下游炎症因子，使母-胎界面炎症反应水平持续升高最终导致流产等不良妊娠结局发生。而巨噬细胞在免疫炎症激活过程中亦扮演重要角色，其主要分为M1 和M2 亚型，正常机体中M1/M2 处于动态平衡状态以维持免疫稳态正常，而免疫微环境改变后巨噬细胞更多向M1 分化，并促进下游促炎因子表达上调，进而使局部炎症水平持续升高。研究发现，母-胎界面Treg 细胞的表达可调控巨噬细胞的活性促进其更多向M1 型细胞转化［16］。故合理推测Treg 细胞通过调控母-胎界面Th17 细胞和巨噬细胞的活性进而参与到妊娠免疫耐受中。为进一步验证这一猜想，本研究检验了各细胞相关因子的表达情况。IL-17 是Th17 的主要效应因子，可促进基质金属蛋白酶、趋化因子和炎性细胞因子表达并继发引起组织破坏和细胞浸润等病理改变［17］；IL-23主要由P40 和P19 亚单位组合产生，其能参与调控CD4+T 细胞增殖并继发引起IL-17 过表达；IL-10 是机体重要的抗炎因子，与巨噬细胞的表达类型及水平密切相关；IFN-γ 是具有广泛免疫调节作用的淋巴因子在机体免疫调节中扮演重要角色。IL-6 是机体经典的促炎因子，可激活下游炎性因子的表达进而促进机体炎症水平持续上升，研究发现，IL-6可通过调控CD4+T 细胞向Th17 分化进而参与免疫炎症反应的激活，同时IL-6 可诱导CD4+T 细胞向Treg 分化并发挥免疫逃逸和免疫抑制作用［18］。结果显示，URSA 组IL-17、IL-23、IFN-γ、IL-6 表达显著低于对照组，且Pearson 检验结果显示Treg 细胞的表达与Th17 细胞及巨噬细胞存在显著相关性，证实妊娠期妇女蜕膜组织中Treg 细胞的表达改变可通过调节Th17 细胞及巨噬细胞活性，进而激活下游炎症信号并影响妊娠结局。

综上所述，妊娠期妇女脱模组织中调节性T 细胞的表达可参与Th17 细胞及巨噬细胞的分化增值，并激活下游炎症因子的表达，进而在妊娠期免疫耐受中发挥重要作用。然而本试验仍存不足，如样本量过少，且仅以同期人工终止妊娠妇女作为对照，而未纳入健康群体进行对比，故今后仍需进一步设置长周期大样本试验予以论证。