肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血患者血清miR-9a-5p表达水平与再出血的关系

邓念菊，吴丽玲，叶小苗，邝继孙

食管胃底静脉曲张破裂出血是肝硬化门静脉高压的常见并发症之一，亦是肝硬化门静脉高压相关死亡的主要原因之一［1］。有研究报道称，肝硬化食管胃底静脉曲张破裂后再出血率为30%～40%［2］。近年来随着医疗技术的发展，肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血的治疗方式也在不断增多，如胃镜下食管静脉曲张套扎术、食管静脉曲张组织胶注射术及经颈静脉肝内门体静脉分流术。这些治疗方式虽能够有效治疗出血情况，但仍有患者治疗后发生再出血［3-5］。因此，探究肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血治疗后再出血的相关风险因素有着重要意义。微小核糖核酸-9a-5p（microRNA-9a-5p，miR-9a-5p）表达水平与门静脉压有关，其在门静脉高压环境下表达水平被上调，促进肝星状细胞增殖、迁移和活化［6-7］。肝星状细胞的持续激活是肝硬化门静脉高压的关键［8］。由此，可推测miR-9a-5p表达水平与门静脉高压诱发的食管胃底静脉曲张破裂出血有关。目前，鲜有研究分析血清miR-9a-5p 表达水平与肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血后再出血的关系。本研究旨在探究肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血患者血清miR-9a-5p 表达水平与再出血的关系，以期为该类患者治疗后再出血的预防和治疗提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018 年2 月至2019 年3 月在海南省人民医院就诊的189 例肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血患者作为观察组，观察组患者根据是否发生再出血分为未再出血组（n=125）和再出血组（n=64）2 个亚组。另选择同期50 例不伴食管胃底静脉曲张的肝硬化患者作为对照组。对照组纳入标准：（1）肝功能减退+门静脉高压证据或病理活检确诊为肝硬化；（2）经胃镜检查确诊为无食管胃底静脉曲张；（3）年龄、性别、肝硬化病因及Child-Pugh 分级资料等临床资料完整。排除标准：（1）伴血液系统疾病；（2）恶性肿瘤。观察组纳入标准：（1）肝功能减退+门静脉高压证据或病理活检确诊为肝硬化；（2）经胃镜检查确诊为食管胃底静脉曲张；（3）呕血或黑便；（4）首次食管胃底静脉曲张破裂出血；（5）年龄、性别、肝硬化病因及Child-Pugh分级资料等临床资料完整。排除标准：（1）有先天胆道阻塞性疾病、门静脉高压性胃肠病或血液系统疾病；（2）非肝硬化引发的消化道出血；（3）恶性肿瘤；（4）随访失联。观察组中男性129 例，女性60例；年龄37～70 岁［（56.69 ± 7.55）岁］；肝硬化病因：慢性乙型肝炎93 例；慢性丙型肝炎34 例；非酒精性脂肪性肝炎36 例；酒精性肝炎26 例；Child-Pugh 分级：B 级106 例，C 级83 例。对照组中男性38 例，女性12 例；年龄37～65 岁［（57.28 ± 7.27）岁］；肝硬化病因：慢性乙型肝炎26 例；慢性丙型肝炎8 例；非酒精性脂肪性肝炎9 例；酒精性肝炎7例；Child-Pugh 分级：B 级31 例，C 级19 例。2 组患者的性别构成（χ2=1.127，P=0.288）、年龄（t=0.495，P=0.621）、肝 硬 化 病 因（χ2=0.176，P=0.981）和Child-Pugh 分级构成比较差异均无统计学意义（χ2=0.566，P=0.452）。本研究符合《世界医学大会赫尔辛基宣言》，经海南省人民医院医学伦理委员会批准。

1.2 临床信息采集 收集肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血患者的年龄、性别、肝硬化病因、Child-Pugh 分级、门静脉内径（由肝脏B 超检查获取）、食管静脉曲张程度［轻度：食管静脉略有迂曲或呈直线形，表面无红斑、红色条纹和血疱（红色征）；中度：食管静脉略有迂曲或呈直线形，有红色征，或呈蛇形，迂曲隆起，但无红色征；重度：食管静脉呈蛇形，迂曲隆起，有红色征，或呈串珠状、结节状或瘤状］、红色征、白蛋白、血小板计数、凝血酶原时间、国际标准化比值、白细胞计数、血钠和血钙等信息。用DxH 600 血细胞分析仪［贝克曼库尔特实验系统（苏州）有限公司］检测血小板计数；用7600 型全自动生化分析仪（日本日立公司）检测血钠、血钙和白蛋白水平；用c3100 全自动血凝仪（迈瑞公司）检测凝血酶原时间和国际标准化比值。

1.3 血清miR-9a-5p 表达水平检测 用实时荧光定量PCR 法检测血清miR-9a-5p 表达水平［9］。抽取对照组和观察组患者治疗前、后（镜下治疗24 h 后）肘部静脉血10 ml，离心后提取血清，将其冻存在-80 ℃冰箱中待测。取冻存的血清，解冻后用RNA 提取试剂盒（日本Takara 公司）提取血清中总RNA；用752 型紫外分光光度计（上海光学仪器五厂有限公司）检测RNA 纯度，吸光度比值（OD260/280）为1.9～2.0；用反转录试剂盒（日本Takara 公司）将RNA 反转录为cDNA；用9700 型PCR 仪（美国ABI 公司）扩增产物，反应条件为95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40 个循环。miR-9a-5p 上游序列：5'-GCGGCGGTCTTTTGGTTATCTAG - 3' ，下 游 序 列：5' - ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'；内参U6 上游序列：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3'，下游序列：5'-AACGCTCTCACGAATTTGCGT-3'。采用2-ΔΔct计算血清miR-9a-5p 相对表达水平。

1.4 预后随访 采用电话或复诊方式随访肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血患者，每1 个月电话随访1 次，每3 个月复诊1 次，末次随访时间为2021年3 月10 日，本研究将至随访结束或随访过程中发生再出血及因再出血诱发的死亡定义为预后不良。

1.5 统计学处理 采用SPSS 23.0 软件包进行数据统计分析。正态分布的计量资料用±s表示，2 组间比较采用独立样本t检验；2 组治疗前后的miR-9a-5p 表达水平比较采用重复测量方差分析。计数资料用百分比（%）表示，2 组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）评价血清miR-9a-5p 表达水平预判再出血的价值。用Logistic 回归分析血清miR-9a-5p 表达水平与肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血预后的关系。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组和对照组患者血清miR-9a-5p 表达水平比较 观察组患者治疗前、后血清miR-9a-5p 表达水平分别为1.87 ± 0.29 和1.58 ± 0.24，均高于对照组的1.08 ± 0.15，差异均有统计学意义（t=26.407、18.200，均P＜0.001）。

2.2 未再出血组和再出血组患者血清miR-9a-5p表达水平比较 未再出血组和再出血组患者血清miR-9a-5p 相对表达水平差异有统计学意义（F=33.974，P＜0.001），未再出血组患者治疗前血清miR-9a-5p 相对表达水平低于再出血组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗前和治疗后的患者血清miR-9a-5p 相对表达水平差异有统计学意义（F=184.973，P＜0.001），未再出血组和再出血组患者治疗后血清miR-9a-5p 相对表达水平均低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）；再出血和时间有交互效应（F=51.963，P＜0.001），未再出血组患者治疗后血清miR-9a-5p 相对表达水平降低程度低于再出血组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 未再出血组和再出血组患者血清miR-9a-5p表达水平比较（± s）

表1 未再出血组和再出血组患者血清miR-9a-5p表达水平比较（± s）

组别未再出血组再出血组t/Z 值P 值例数125 64治疗前1.76±0.25 2.10±0.21 9.265＜0.001治疗后1.59±0.23 1.55±0.26 1.069 0.287变化值0.25（0.11，0.45）0.56（0.33，0.72）5.364＜0.001

2.3 血清miR-9a-5p 表达水平判断再出血的价值 治疗前患者血清miR-9a-5p 表达水平判断再出血的ROC 曲线下面积高于治疗后，差异有统计学意义（Z=5.393，P＜0.001）。见表2 和图1。

图1 血清miR-9a-5p 表达水平预判再出血的ROC 曲线

表2 血清miR-9a-5p 表达水平预判再出血的价值

2.4 未再出血组和再出血组患者的临床特征比较 2 组患者的年龄、性别构成、肝硬化病因构成、血小板计数、凝血酶原时间和国际标准化比值比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。再出血组患者的白蛋白、血钠和血钙水平均低于未再出血组，而Child-Pugh C 级占比、门静脉内径、重度食管静脉曲张占比和红色征占比高于未再出血组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 未再出血组和再出血组患者的临床特征比较

2.5 肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血患者预后的Logistic 回归分析 将肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血患者治疗后是否发生再出血作为因变量，将白蛋白、血钠、血钙、Child-Pugh 分级、门静脉内径、食管静脉曲张程度、红色征和治疗前miR-9a-5p表达水平作为自变量纳入多因素Logistic 回归分析，上述自变量均以各自的中位数为界转换为二分类变量，赋值见表4，结果显示，Child-Pugh C 级、门静脉内径＞1.30 cm、重度食管静脉曲张、红色征和治疗前miR-9a-5p 表达水平＞1.89 是肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血后再出血的独立危险因素（P＜0.05），而血钠＞136.67 mmol/L 是肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血后再出血的独立保护因素（P＜0.05）。见表5。

表4 赋值情况

表5 肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血预后的Logistic 回归分析

3 讨论

再出血是评价肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血治疗后患者预后的重要指标［10］。探究肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血治疗后再出血的相关风险因素是近年来研究的热点。本研究将再出血作为预后评价指标，主要分析血清miR-9a-5p 表达水平与肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血治疗后再出血的关系。

本研究结果显示，观察组患者治疗前、后血清miR-9a-5p 表达水平均高于对照组，提示miR-9a-5p表达水平与肝硬化食管胃底静脉曲张有关，参与了发病和进展过程。此外，未再出血组和再出血组患者治疗后的血清miR-9a-5p 相对表达水平均低于治疗前，未再出血组患者治疗前血清miR-9a-5p 相对表达水平低于再出血组，提示血清miR-9a-5p 表达水平与肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血治疗后再出血有关，探究二者之间的关系，或可对肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血治疗后再出血的预防和治疗提供帮助。本研究构建了治疗前和治疗后血清miR-9a-5p 表达水平判断肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血后再出血的ROC 曲线，结果显示治疗前血清miR-9a-5p 表达水平判断再出血的ROC 曲线下面积为0.839，高于治疗后的0.554，提示治疗前血清miR-9a-5p 表达水平判断再出血的价值较高，可辅助临床决策。

门静脉高压环境下，miR-9a-5p 表达水平被上调，其可促进肝星状细胞活化、增殖和迁移；干扰miR-9a-5p 表达水平，可显著抑制肝星状细胞活化、增殖和迁移［6-7］。肝星状细胞与肝脏微循环环境密切相关，其在肝细胞功能、血管张力调节和炎症控制方面均发挥着重要作用［11-13］。本研究中Logistic回归分析结果显示，治疗前miR-9a-5p 相对表达水平＞1.89 是肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血后再出血的独立危险因素，推测原因可能是miR-9a-5p表达水平与患者肝星状细胞的活化、增殖和迁移密切相关，其可通过诱导肝星状细胞的活化、增殖和迁移促进肝纤维化，增加门静脉压；此外，在门静脉高压环境下，miR-9a-5p 表达水平上调，促进肝星状细胞活化、增殖和迁移，加重肝纤维化进展，进一步促进门静脉压升高。miR-9a-5p 可能通过上述机制调节门静脉压，其表达量可反映肝硬化患者门静脉压高低。门静脉压升高是肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血的重要诱因。因此，血清miR-9a-5p 表达水平可反映肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血后再出血情况。

既往研究［14-17］已证实Child-Pugh C 级、宽门静脉内径、重度食管静脉曲张、红色征和低血钠与肝硬化食管胃底静脉曲张患者发生再出血有关。本研究结果显示，Child-Pugh C 级、门静脉内径＞1.30 cm、重度食管静脉曲张和红色征是肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血后再出血的独立危险因素，而血钠＞136.67 mmol/L 是肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血后再出血的独立保护因素，与上述文献结果一致。既往研究［18-19］报道了白蛋白和血钙水平与肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血有关，本研究结果显示再出血组的白蛋白和血钙水平均低于未再出血组，提示二者与肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血后再出血有关。但本研究中Logistic 回归分析结果显示，白蛋白和血钙水平与肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血后再出血无关，推测该差异可能与样本量大小有关，后续还需增加样本量进一步分析二者与肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血后再出血的关系。

本研究尚存在一定不足，仅分析了治疗前和治疗后血清miR-9a-5p 表达水平与肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血治疗后再出血的关系，对于其他时点的血清miR-9a-5p 表达水平对肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血后再出血的预示作用还未阐明；此外，本研究样本量有限，分析结果可能有一定偶然性，后续将针对以上不足进行进一步研究。

综上所述，治疗前患者血清miR-9a-5p 表达水平与肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血后再出血有关。对于治疗前血清miR-9a-5p 表达水平高的肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血患者，应加以重视，避免不良事件发生。