氨基酸维生素对力竭游泳大鼠骨胳肌超微结构及相关酶的影响

惠华强，孙金山，徐纪平，肖立宁，黄 文，李兆申

疲劳是一种复杂的生理和心理现象，是机体脑力与体力活动过度，精神刺激过多，反复做某种单调活动所致。骨骼肌在运动性疲劳的发生、发展和损害中是最主要的靶器官，研究已证实疲劳进程转归与骨骼肌细胞的结构、酶学等变化密切相关［1-2］。氨基酸和维生素是维持人体生命活动必需的有机物，也是保持人体健康的重要活性物质，氨基酸和维生素的缺乏是导致和加重疲劳的主要原因之一，也是造成疲劳不能快速恢复的重要因素之一［3-4］。目前，关于氨基酸维生素制剂抗疲劳的研究报道较少，本研究将观察氨基酸维生素制剂对游泳力竭大鼠骨胳肌超微结构及相关酶谱的影响，初步探讨氨基酸维生素制剂缓解运动疲劳的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠36只，体质量200～220 g，购自第二军医大学实验动物中心，分笼饲养，每笼6只。

1.2 主要试剂与设备 复方氨基酸胶囊(商品名为和安)，批号为091108，其组份为8种人体必需的氨基酸和11种维生素;氨基酸果糖粉固体饮料(商品名为万和威力特)，批号为20091103，每袋15 g，配料为果糖、柠檬酸、谷氨酰胺、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、维生素C、食用香精、氯化钠、活性钙等，均为深圳万和制药有限公司产品。日立H-7650分析透射电镜(日立公司产品)，大鼠腓肠组织中calpain-1、calpain-2、ubiquitin、一氧化氮合酶(NOS)检测试剂盒(南京建成生物研究所产品)。

1.3 动物模型制作 采用数字表法将36只SD大鼠随机分为3组:复方氨基酸胶囊组(胶囊组)，给予胶囊3粒溶于500 ml饮用水中;空白对照组(对照组)，给予普通饮用水;氨基酸果糖粉固体饮料组(冲剂组)，给予饮料30 g溶于500 ml饮用水中。所有动物给予国家标准啮齿类动物饲料，自由摄食，动物房温度21～23℃ ，相对湿度50% ～55%。所有动物实验前均未受过任何刺激干扰，实验前先给予适应环境饲养5 d。采用无负重游泳方式建立大鼠运动疲劳模型，实验时间总长为14 d。在内壁光滑的泳池中进行训练，水深50 cm，水温(25±1)℃，每池次游泳大鼠6只，游泳过程中防止大鼠互相拽抱。第1～3天，游泳训练时间为30 min;第4～6天，每天递增10 min;第7～9天，每天1次力竭性游泳训练;第10～14天，每天2次力竭性游泳训练，2次间隔6 h。游泳力竭的标准:大鼠沉到水下10 s仍不能返回水面，出水后呼吸深急、幅度大，双目无光，反应迟钝，体位为俯卧或端坐，被握持时四肢下垂。

1.4 指标观察 于末次力竭游泳结束后1 h(实验第14天)进行，用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，处死后立即取3组大鼠的右侧腓肠肌组织，0℃下切成约1 mm3大小，经俄酸处理，环氧树脂包埋，超薄(0.1 μm)切片，醋酸双氧铀染色，电镜下观察骨骼肌超微结构。冰袋上迅速分离腓肠肌，置－80℃冻存;精确称重，冰浴中超声粉碎成匀浆液，4℃静置10 min，3000 ×g低温离心15 min;取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后分装，－80℃冻存待检测。

1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差()表示，组间比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨骼肌超微结构变化 胶囊组和冲剂组肌细胞胞质内线粒体和肌丝结构基本完整，肌纤维排列尚整齐，肌浆网组织清晰，未见断裂和空泡样变。对照组肌细胞明显肿胀变性，线粒体可见不同程度损伤，伴有膜、嵴松散、弯曲、溶解、断裂现象，甚至出现空泡化。见图1。提示补充氨基酸维生素制剂可以有效地降低力竭疲劳造成的大鼠骨骼肌损伤，提高大鼠抗疲劳损害的能力。

图1 3组大鼠骨骼肌超微结构变化(HE×15 000)

2.2 骨骼肌相关酶检测 胶囊组和冲剂组大鼠腓肠肌组织中calpain-1、calpain-2和ubiquitin与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，NOS与对照组比较差异也有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 3组大鼠骨骼肌相关酶检测(μmol/g，)

表1 3组大鼠骨骼肌相关酶检测(μmol/g，)

注:与对照组比较aP＜0.05;NOS为一氧化氮合酶

3 讨论

疲劳，尤其是力竭运动所致疲劳的发生和发展过程中骨骼肌将消耗大量的能量，ATP是主要的供能物质，ATP水平对骨骼肌生理功能的维持和细胞生存是十分重要的，骨骼肌的收缩和舒张均需要细胞内ATP的消耗，Ca2+-ATP酶通过水解ATP而将细胞内Ca2+泵到肌浆网间隙中，当持续或过度肌肉收缩和舒张后，导致骨骼肌疲劳，可出现ATP储备的降低、线粒体的“过劳”及其结构的破坏［5-6］。本研究中，笔者观察力竭游泳疲劳大鼠模型线粒体超微结构，发现骨骼肌线粒体肿胀，并有不同程度损伤，伴有膜、嵴松散、弯曲、溶解、断裂现象，甚至出现空泡化。提示线粒体作为将多种食物性底物转化为化学能、产生ATP和热能的主要细胞器，不仅在疲劳的发生、发展中扮演着关键角色，而且在预防和快速恢复疲劳的研究中也是重要的突破口。

Calpain是钙激活中性半胱氨酸内肽酶，包括calpain-1、calpain-2和 calpain-3等多种同工酶。研究表明，calpain参与骨骼肌细胞内游离Ca2+浓度的调节，激活不同信号通路，发挥促进和愈合骨骼肌损伤的功效［7］。Ubiquitin是由76个氨基酸组成的多肽链，其序列具有高度保守特点，骨骼肌蛋白质在降解前需要多聚泛素链相连接，即产生蛋白质的泛素化。疲劳发生时，ubiquitin大量激活使蛋白质被特异性识别、结合并迅速降解［8］。NOS是一种同工酶，分别存在于内皮细胞、巨噬细胞、神经吞噬细胞及神经细胞中，在损伤修复和组织再生中起重要作用，可以催化产生一氧化氮(NO)，促进骨骼肌缺血损伤的修复［9］。本研究中，笔者对力竭游泳疲劳大鼠骨骼肌组织中calpain、ubiquitin和NOS进行检测，结果发现伴随骨骼肌线粒体的损害、ATP浓度降低，组织中calpain、ubiquitin升高，NOS降低，提示骨骼肌过度疲劳可导致组织的损伤及相关酶的变化。

氨基酸是与生命活动密切相关的蛋白质的基本组成单位，是人体必不可少的物质，氨基酸在运动过程中提供能量，且与运动能力有密切的关系。支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等)是一类主要在肌肉中代谢的氨基酸。有研究表明，在动物或人体运动过程中补充支链氨基酸后，具有提高机体的运动能力、延缓疲劳的发生，加快疲劳恢复等作用［10］。研究也表明精氨酸是体内NO合成的前体物质，运动中可刺激机体分泌多种重要激素，同时在尿素循环中可加速氨排出体外、延缓疲劳发生［11］。本研究观察到，给予适当的氨基酸和维生素制剂干预可以明显减轻力竭疲劳大鼠骨骼肌的损伤，同时可以观察到calpain、ubiquitin的降低和保护性物质NOS的增高。补充氨基酸维生素制剂对于预防和快速恢复力竭疲劳所致大鼠骨骼肌的损伤有明显的作用效果，可能成为一种具有良好抗疲劳作用的遴选制剂。

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