杞藿饮对力竭游泳大鼠肝细胞衰老及其超微结构的影响

徐纪平，刘保海，孙金山，肖立宁，陈来国，黄 文，李兆申

古今中外的战争史均已证实，作战疲劳是影响部队战斗力的重要原因，如何在长时间持续作战中维持战斗力及作战后快速恢复疲劳，是国内外军事医学尤其是军事作业医学研究的重点课题之一。益气滋阴、补精养神是对抗疲劳和快速恢复疲劳的有效手段。杞藿饮由刺五加、枸杞、淫羊藿、马齿苋、红景天、当归、肉苁蓉等药物配伍而成，具有益气滋阴、补精养神等功效［1］。本实验观察杞藿饮对力竭游泳大鼠肝细胞衰老及其超微结构损伤的保护作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)杞藿饮，由中国中医科学院研制的杞藿速释片改良而成，由刺五加、枸杞、淫羊藿、马齿苋、红景天、肉苁蓉等组成，由济南军区青岛第一疗养院中医科煎制和浓缩，制成杞藿饮原汁、75%稀释和1.5倍浓缩3种煎剂备用。(2)大鼠血清一氧化氮(nitrogen monoxidum，NO)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate amino transferase，AST)试剂盒，均购自南京建成科技有限公司;肝细胞H2A磷酸化染色试剂盒为Sigma公司产品，超微结构观察使用日立H-7650分析透射电镜。

1.2 动物及分组 清洁级SD大鼠48只，雄性，体质量(170±10)g，由第二军医大学实验动物中心提供。大鼠适应性喂养1周后，按数字表法随机分为4组，每组12只，分别为:游泳对照组，蒸馏水灌胃;杞藿饮高(1.5倍浓缩液)、中(原液)、低(75%稀释液)3个浓度实验组，按15 ml/kg体质量给予相应浓度杞藿饮煎剂灌胃，每日2次，其间大鼠自由饮水。力竭游泳实验在100cm×60cm×60cm的塑料泳槽桶中进行，水深50cm，水温(31±1)℃。大鼠力竭运动疲劳按Thomas报道的标准进行判断:大鼠沉入水中10 s不能自主上水面，且放在平面上无法完成翻正反射。实验为期3周。

1.3 指标检测与评价 (1)标本收集。实验第22天，从各组大鼠腹主动脉取血后，迅速解剖取肝脏组织，用冰冷的生理盐水冲净血渍，放入冻存管后置于液氮罐中保存待测。(2)血清NO、ALT和AST活性测定。所取主动脉血不加抗凝剂收集，3000×g离心20 min，吸取上清液，全自动生化分析仪检测NO、ALT和AST活性。(3)肝脏细胞H2A磷酸化染色。采用ABC染色法，按试剂盒方法操作，计数5个高倍镜视野下肝脏组织中H2A阳性细胞数目，取平均值作为该标本肝细胞衰老指数，用以评价肝细胞衰老的状况。(4)肝脏超微结构观察。肝脏标本经锇酸、梯度脱水、树脂包埋固化、超薄(70 nm)切片，再经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色，透射电镜下观察拍照。

1.4 统计学处理 应用SPSS 16.0软件进行统计学处理。所有数据以均数±标准差(±s)表示，组间差异用方差分析，P＜0.05为有差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对肝脏生化指标的影响 实验第22天，高、中、低浓度杞藿饮组大鼠血清NO、ALT、AST与游泳对照组比较均明显降低(P＜0.05)，高、中浓度杞藿饮组大鼠血清NO、ALT、AST与低浓度组比较降低更明显(P＜0.05)。提示，杞藿饮对力竭游泳所致大鼠肝脏损害具有保护作用，且与浓度呈正相关。见表1。

表1 各组大鼠血清NO、ALT和AST活性比较(±s)

表1 各组大鼠血清NO、ALT和AST活性比较(±s)

注:NO为血清-氧化氮;ALT为丙氨酸氨基转移酶;AST为天门冬氨酸氨基转移酶。与游泳对照组比较aP＜0.05;与低浓度杞藿饮组比较bP＜0.05

组别 动物数 NO(mmol/L) ALT(U/L) AST(U/L)游泳对照组12 68.20±11.23 218.01±43.77 793.80±63.44低浓度杞藿饮组 12 54.03±10.74a 149.82±32.73a 582.18±49.37a中浓度杞藿饮组 12 47.61±9.94ab 118.31±27.92ab484.11±63.39ab高浓度杞藿饮组 12 46.85±12.34ab121.81±26.66ab430.41±42.89ab

2.2 对肝细胞衰老的影响 肝脏衰老细胞磷酸化染色呈棕褐色，见图1。计数各组每只大鼠各3个高倍(200倍)镜视野下每100个肝细胞中阳性细胞数，取平均值为衰老指数。低、中、高浓度杞藿饮组的衰老指数分别为7.99±0.55、7.33±0.49、6.85±0.74，与游泳对照组(10.05±1.09)比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。3个杞藿饮组肝细胞H2A磷酸化阳性细胞均明显少于游泳对照组(P＜0.05)，提示杞藿饮可以降低肝脏细胞衰老程度。

图1 各组大鼠衰老肝细胞H2A染色结果(×200)

2.3 对肝细胞超微结构的影响 电镜下可见，游泳对照组大鼠肝细胞基质松散，内质网排列紊乱，线粒体肿胀伴萎缩，出现嵴断裂、消失、空泡样变;3个杞藿饮组大鼠肝细胞病变较轻，线粒体基本正常，呈椭圆形，未见嵴断裂，无空泡样变。见图2。提示杞藿饮可以降低疲劳大鼠肝细胞损伤程度。

图2 各组大鼠肝细胞电镜下超微结构(×25 000)

3 讨论

中医理论认为，持续疲劳主要耗气伤阴，睡眠剥夺主要耗精伤神。因此，益气滋阴、补精养神应该是修复疲劳的有效手段。应用淫羊藿、人参、黄芪、红景天、刺五加、枸杞子、五味子等益气养阴、益精宁神的中药修复疲劳是可行的。杞藿饮以益气养阴、益精宁神等多味药物组成，以淫羊藿和枸杞为主要配方。目前研究已证明淫羊藿具有抗应激、抗疲劳等作用，可促使患者术后白蛋白、转铁蛋白水平的恢复，减少术后的疲劳程度，且能增强机体的免疫功能［2-3］。枸杞具有增强和调节免疫功能、增强造血功能、抗肿瘤等作用［4-5］。这些药物合用对抗疲劳有明显的功效。

肝脏是人体最大的腺体，肝脏与运动的关系极为密切，运动时血液的重新分布会导致肝脏等内脏器官血供减少，运动时能源物质的消耗和代谢产物的堆积等也都会从不同方面影响肝脏组织的结构和功能［6-7］。本研究观察到，力竭游泳大鼠伴有明显的肝脏损伤，表现为NO、ALT、AST等酶谱的改变，电镜下线粒体损伤，给予杞藿饮可以减轻肝脏的损伤程度，肝酶谱明显降低。由此认为，杞藿饮对预防疲劳所致的肝脏损伤及对疲劳的快速恢复起重要作用。

细胞衰老是细胞生命活动的客观规律［8］。细胞凋亡通常作为评定运动性疲劳与恢复的可行性指标，一般认为程序性细胞衰老凋亡是一种利他性、生理性细胞死亡，即局部、个别的死亡有利于整体或种群的存活［9］。与以往研究观察疲劳动物的肝细胞凋亡不同，本研究重点观察肝细胞的衰老状态，通过观察细胞衰老指数，判断疲劳对肝脏的损伤程度，进一步观察到抗疲劳制剂杞藿饮能够有效降低肝细胞的衰老，进而减少细胞的凋亡，保护肝脏功能，达到缓解运动性疲劳的效果。

［1］阿古拉，李东涛，李富玉.杞藿速释片提取工艺的研究［J］.内蒙古中医药，2009，16(6):113-114.

［2］张红旭，韩枫.淫羊藿多糖抗疲劳、耐缺氧作用的实验研究［J］.中国药物警戒，2011，8(7):391-392.

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［4］刘英伟，刘忠民，王浩天，等.枸杞多糖和1，6-二磷酸果糖协同抗运动疲劳作用及其机制［J］.吉林大学学报:医学版，2012，38(4):692-696.

［5］孙伟，苗珍花，王亚玲，等.宁夏枸杞叶对自然衰老小鼠的抗疲劳作用［J］. 宁夏医科大学学报，2011，33(3):204-206.

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［7］卢峻，葛桂玲，张红林，等.艾灸对运动性疲劳大鼠肝糖原及肝脏超微结构的影响［J］.针刺研究，2011，36(1):32-35.

［8］Ivancik J，Majd H，Bajaj D，et al.Contributions of aging to the fatigue crack growth resistance of human dentin［J］.Acta Biomater，2012，8(7):2737-2746.

［9］Lee FT，Kuo TY，Liou SY，et al.Chronic Rhodiola rosea extract supplementation enforces exhaustive swimming tolerance［J］.Am J Chin Med，2009，37(3):557-572.