阿托伐他汀钙微球对高血脂症模型大鼠降脂作用研究①

张向宇, 吴明聪， 孟祥祎， 张 杰

(佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007)

0 引 言

阿托伐他汀钙(ATC)是他汀类药物中一种有竞争性和选择性的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-Co A)还原酶抑制剂[1-3]。ATC通过抑制肝脏内HMG-Co A还原酶和胆固醇(CH)的合成从而降低血浆中CH和脂蛋白水平，并通过增加细胞表明的肝脏低密度脂蛋白(LDL-C)受体以增强LDL-C的摄取和代谢，而被广泛使用于高脂血症和动脉粥样硬化临床患者[4,5]。市售的剂型主要包括片剂，胶囊和分散片[6,7]。虽然ATC的临床疗效显著，口服的吸收快，但会造成患者胃肠道不适，患者会出现视觉模糊以及味觉障碍及头晕、皮疹等不良反应，并且其生物利用度依然受其水溶性差和首过效应的限制[8]。因此，研发新制剂以降低 ATC 的不良反应并提高其疗效显得尤为迫切。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是被美国FDA批准的可用于药品生产的药物载体，安全无毒，生物相容性良好[9.10]。本研究设计载ATC注射用PLGA微球，采用复乳-溶剂挥发法制备微球，考察微球的形貌、粒径、化学组成和晶体结构等性质，评价微球的体外释放情况，研究高血脂模型大鼠降血脂作用。通过本研究达到延长药物作用时间、降低肝脏首过效应作用的目的，为研制阿托伐他汀钙微球注射制剂提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

PLGA-COOH(聚合比例为 50:50，分子量为10000，山东省药学科学院)；阿托伐他汀钙标准品(J1203AS, 大连美仑生物技术有限公司)；阿托伐他汀钙原料药(20180325, 武汉远成共创科技有限公司)；聚乙烯醇(青岛优索化学科技有限公司)；甘露醇(沈阳市中试剂厂)；36 mm透析袋 分子量8000-14000(美国Viskase Size 5)；甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)；磷酸二氢钾(天津市科密欧化学试剂有限公司)；氢氧化钠(天津市科密欧化学试剂有限公司)；二氯甲烷(辽宁泉瑞试剂有限公司)水为纯化水；其他均为分析纯。

1.2 实验仪器

高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)，高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，扫描电子显微镜(南京大学仪器厂)，激光粒度分布仪(岛津仪器(苏州)有限公司)，高速冷冻台式离心机(TGL-16G-C上海安亭科学仪器厂)。

1.3 实验动物

实验动物由哈尔滨医科大学提供，SPF 级 SD 雄性大鼠50 只，185～225 g，将其饲养于佳木斯大学动物中心，合格证编号GYK(鲁)20180007。

1.4 微球的制备

采用复乳-溶剂挥发法制备在阿托伐他汀钙微球(ATC-MSs)，取一定浓度的 PVA 溶于100 mL 纯化水中作为外水相。精密称取适量 ATC 以及 PLGA，加入到二氯甲烷( DCM) 与丙酮( ACE) 混合有机溶剂中，振摇溶解，超声使其分散均匀，随后加入适量纯化水，在冰浴条件下，超声得到乳白色液体，即 W/O乳液。室温下将其缓慢滴入高速剪切的 PVA 水溶液中，得W/O/W型乳液。再加入50 mL浓度为2%异丙醇水溶液，继续搅拌 8 h至微球固化，离心纯化水洗涤微球 3次，加入适当的冻干保护剂冻干24 h，收集，即得ATC-MSs。

2 ATC-MSs的质量评价

2.1 ATC-MSs的形态学考察

取适量微球，用纯化水溶解，放在载玻片上，光源调节至10×40，显微镜下观察微球的外观。通过扫描电子显微镜( SEM) 观察微球的表面形貌，取少量制备的 ATC-MSs，在纯化水中溶解，将微球用离子溅射仪进行表面喷金处理，观察其表面外观形态。

2.2 ATC-MSs粒径及粒度分布

使用激光粒度分析仪分析，将微球用纯化水溶解，分散均匀，测定其粒径及粒度分布。

2.3 ATC-MSs的红外光谱扫描

采用傅立叶红外光谱仪分析，称取适量PLGA,ATC以及与空白微球与ATC的物理混合物、ATC-MSs，分别将样品与 KBr 充分混合，压成透明薄片。进行 FT-IR 光谱扫描分析药物与载体材料在制备中是否有相互作用，扫描范围是400～4000 cm-1。

2.4 ATC-MSs差示量热扫描的测定

通过对ATC、空白微球、ATC-MSs、空白微球与ATC的物理混合物测定，对药物在微球内的晶型变化与ATC的包裹状态进行研究。

2.5 ATC-MSs体外释放

(1) 色谱条件

色谱柱：Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈：醋酸铵缓冲液(50:50，V/V)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：室温；检测波长：247 nm；进样量：20 μL[16]。

(2) 标准曲线的制备

精密称取ATC标准品，用含1 %吐温80的PBS缓冲液(pH=7.4,pH=6.8)作为溶剂，配制成浓度分别为20,40,60,80,100 μg·mL-1，在247 nm波长下，绘制标准曲线。

(3) 精密度试验

分别用pH7.4,pH6.8含1 %吐温80的PBS缓冲液作为溶剂，配置浓度为20 μg·mL-1，60 μg·mL-1，100 μg·mL-1的低中高三个ATC样品溶液，一天测定五次，计算日内精密度。连续测量五天，每日一次，计算日间精密度。

(4) 稳定性试验

分别在0 h，1 h，2 h，4 h，8 h，12 h，16 h和24 h测定60 μg·mL-1ATC样品浓度，平行测定五次，计算峰面积。

(5) 体外释放考察

采用透析法进行体外载药微球的药物释放试验：分为9组，其中ATC原料药3组，PBS 缓冲液(pH=7.4)介质下的ATC-MSs 3 组、1 %Tween-80 的 PBS 缓冲液(pH=6.8)介质下的ATC-MSs 3 组，将微球置于处理好的透析袋中( MWCO= 8 000～14 000)，37 ℃ 100 r/min 恒温震荡搅拌；设定连续取样时间，取样量为 1 mL以待分析，同时补充等量相应的释放介质。释放样品的浓度采用 HPLC 测定，代入标曲计算 ATC 的累积释放量。

2.6 ATC-MSs对高血脂模型大鼠降脂作用研究

(1) 动物分组与造模

将大鼠随机分为 6 组：正常组、高血脂模型组、阳性对照组、阿托伐他汀钙微球高、中、低剂量组，每组 7 只。所有大鼠均给予普通饲料、饮水自由，正常组灌服同等剂量的蒸馏水，其余 5 组灌服自制高脂乳剂，每日 1 次。2 周后，对正常组和高脂乳剂组腹主动脉取血，测总胆固醇水平，证实造模成功。

(2) 给药方法

证实造模成功后大鼠开始药物治疗，正常组、模型组注射 10mg·kg-1的生理盐水、阳性对照组注射同等剂量的藻酸双酯钠、高中、低、剂量组注射剂量分别为 20mg·kg-1,10mg·kg-1,5mg·kg-1的冻干粉。阳性对照组和空白组每日一次，连续 6 天，ATC组三天注射一次。

(3) 检查指标

麻醉大鼠后腹主动脉取血，将血液在4℃静置30min，离心分离血清，按试剂盒提供的方法分别测定血液中 TC,TG,HDL-C,LDL-C,ALT,AST水平。

3 结果与讨论

3.1 ATC-MSs的表征结果

扫描电子显微镜观察微球表面形貌，如图1(a)，微球的外观的形态呈现出良好的球形形态，较为圆整、表面平滑、无粘连出现。利用激光粒度分布仪测定ATC-MSs的粒径，结果显示微球的平均粒径为(2.048±0.15)μm，且大小分布均匀，如图1(b) 所示呈正态分布。

图1(a) 微球SEM表面形貌, (b) 微球的粒度分析

3.2 阿托伐他汀钙微球的红外光谱测定

在400～4000 cm-1波长范围内扫描结果见图 2。ATC原料药中 3010cm-1,1601cm-1,1496cm-1是芳氢伸缩振动峰，3335cm-1是酰胺中氮氢键的伸缩振动峰，1395cm-1是酯键，815 cm-1，755 cm-1是有机卤化物F-吸收峰。在空白微球中，3420cm-1是羟基伸缩振动峰，1755cm-1是 PLGA 酯基伸缩振动峰。载药微球中，除与ATC原料药和空白微球共有的酯类吸收峰和羟基伸缩振动峰外，在 1625cm-1，1750cm-1处出现了内酯的羰基吸收峰，说明药物被成功包裹在微球中[11]。

图2 微球的红外光谱测定

3.3 差示量热扫描测定

如图3所示，40°C是 PLGA 的吸收峰，明显可见有三个尖峰，分别是物理混合物、ATC-MSs和空白微球。142°C是ATC的吸收峰，明显可见两个尖峰是ATC和物理混合物，ATC-MSs在此处尖峰消失。说明ATC以无定形状态分散在微球结构中。

图3 微球差示量热扫描的测定

3.4 体外释放考察

(1) 标准曲线的制备

经测定，pH=6.8条件下ATC的标曲方程A=43.064C-452.55(r=0.9998)，pH=7.4条件下的标曲方程为A=50.788C+315.55(r=0.9995)。在20.00～100.00μg/mL浓度范围线性关系良好。

(2) 精密度考察

由“2.5.3”项下实验方法测得不同pH条件下ATC的精密度，结果见表 1。不同pH条件下ATC日内及日间精密度的RSD值均小于3 %，精密度良好，均符合方法学要求。

表1 不同pH条件下ATC内(间)精密度测定结果(n=5)

(3) 稳定性试验

由“2.5.4”项下实验方法考察ATC在不同pH PBS缓冲液中的稳定性，结果见表2。结果表明，ATC在不同pH的PBS缓冲液中的RSD值均小于3%。

表2 阿托伐他汀钙稳定性测定结果(n=5)

(4) 体外释放考察

图4 (a) ATC标准曲线(pH6.8), (b) ATC标准曲线(pH7.4)

图5 不同pH条件下ATC及ATC-MSs的体外释放情况(n=3)

通过最佳工艺处方制备的阿托伐他汀钙微球的载药量为10.14±0.34 %，包封率为80.12±1.28 %，在该工艺条件下考察载药微球的体外释放情况。如图4，在 pH=6.8 介质中考察释放情况，在 0～8 h 累积释药量为 46.71 %，在 24 h 累积释药量为 58.80%，至第 9 天累计释药量接近 90%，释药过程平稳；在 pH7.4介质中考察释放情况， 0～8 h 累积释药量为 36.87 %，在 24 h 累积释药量为 47.64%，至第 9 天累计释药量已接近 80%，且释药过程平稳。结果说明当血脂异常体液 pH 偏低的情况下，药物释放情况更好。通过微球包覆，ATC释放时间延长，载药微球具有缓释性能。

3.5 ATC-MSs对高血脂模型大鼠降脂作用研究

(1) 对血清脂质水平的影响

结果图 6(a),6 (b),6(c),6(d)所示，模型组TG,TC,LDL-C含量明显高于正常组，具明显差异，可证明造模成功；ATC组和阳性对照组血清中TG,TC含量较模型组有明显降低，HDL-C含量有明显升高；ATC高、中剂量组、阳性对照组血清中LDL-C含量与模型组比较有明显降低。说明载ATC微球具有明显的降血脂作用。

图6(a)各组大鼠血清TG的比较, (b) 各组大鼠血清TC的比较，6(c) 各组大鼠血清HDL-C的比较， 6(d) 各组大鼠血清LDL-C的比较.

(2) 对血清酶水平的影响

结果图7(a)、7(b)，ATC高、中、低剂量组大鼠与模型组相比AST与ALT显著降低，正常组、阳性对照组相比模型组有明显降低。说明载药微球能有效降低模型大鼠肝脂质水平，同时具有保护肝脏的作用[12.13]。

图7(a) 各组大鼠血清AST的比较，7(b) 各组大鼠血清ALT的比较

4 结 论

本实验采用复乳-溶剂挥发法制备了 W/O/W 型高分子载药微球。通过扫描电镜、傅里叶红外光谱分析、差示量热仪对微球进行质量评价，结果表明，载阿托伐他汀钙聚合物微球具有良好的表面形态和晶型特征。对微球药物体外释放的考察，本文建立了 HLPC 法测定了 ATC-MSs体外释放度的测定方法，在 20～100ug/mL 内 ATC线性关系良好，且在 pH=6.8与 pH=7.4 的 PBS 介质中均释药过程平稳且无突释，明显延长了 ATC的释放时间，达到了预期的缓释效果。对大鼠造高血脂模，通过ATC组与模型组、阳性对照组的比较，测定血清指标发现 ATC-MSs具有明确降低高血脂的作用，能有效降低高血脂症模型大鼠血清中 TC,TG,LDL-C 水平。正常组与模型组相比较结果显示，ALT 与 AST 水平显著下降，说明ATC-MSs 具有降血脂作用，同时保护肝脏的作用。