幽门螺杆菌导致上皮间质转化的研究进展

宁月，王蒙，邵利华，焦婷红，李海龙，4

1.甘肃中医药大学第一临床医学院，甘肃兰州 730000；2.甘肃省中医方药挖掘与创新转化重点实验室，甘肃兰州 730000；3.甘肃中医药大学附属医院临教科，甘肃兰州 730000；4.甘肃省中药新产品创制工程实验室，甘肃兰州 730000

上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transi-tion, EMT）是上皮细胞转化为能动细胞的过程。通常，细胞极性及细胞之间的黏附连接限制了上皮细胞随意移动的能力。但在特定生理或病理状态下，上皮细胞极性丧失、黏附能力降低、细胞骨架发生变化[1]，使细胞运动和迁移能力增强，这种变化即为EMT[2]。肿瘤中常见EMT 的发生[3]，而EMT 的激活与炎症反应二者相互支持共同促进肿瘤进展[4]。既往研究表明，在幽门螺杆菌（helicobacter pylori, Hp）感染的胃黏膜上皮细胞中，炎症会促进EMT 的发展，继而诱导胃黏膜内致癌改变，导致胃癌发生[5]。因此，研究Hp 导致EMT 的机制对于探索胃癌的发生有重要的作用。

1 EMT 的特征

EMT 是上皮细胞形态发生改变并失去连接和极性，摆脱细胞间和细胞外基质黏附状态的一个动态过程[6]。当EMT 启动开始，上皮细胞逐渐转化为间充质状态，并沿上皮（E）轴与间充质（M）轴排列，而当这一动态程序完成时，细胞形态转为纺锤状，具有高度运动性和侵袭性[7]。与此同时，一些分子的表达也发生变化，如细胞粘附分子E-钙黏蛋白（epithelial-cadherins, E-cadherins）、闭合蛋白（occludins）、紧密连接蛋白（claudins）和细胞角蛋白（cytokeratins）表达下调，而间质细胞标志物间充质钙粘蛋白（mesenchymal cadherins）、波形蛋白（vimentin）和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）表达协同上调[8]。锌指蛋白（snails）、E-box 结合蛋白（zinc finger E-box binding proteins, ZEB）、基本螺旋-环-螺旋蛋白（twists）、和叉头盒蛋白（FOXCs）等因子的上调并激活Vimentin 或N-钙黏蛋白（neuralcadherin, N-cadherin）直接抑制了E-cadherins 的表达[9-10]。一些炎症因子如转化生长因子（transforming growth factor β, TGF-β）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor alpha, TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin 6, IL-6）、白细胞介素-8（interleukin 8, IL-8）和一些趋化因子如C-C 基趋化因子配体5（Cchemokine ligand 5, CCL5）、C-C 基趋化因子配体18（C-chemokine ligand 18, CCL18）等的表达也促进了EMT 的发展[11]。EMT 在促进癌细胞迁移的过程中，受到不同信号传导通路的控制，如PI3K/AKT/mTOR通路、Wnt/β-连环蛋白、P53 信号通路等，它们共同构成了EMT 复杂的调控网络[12]。

2 幽门螺杆菌的特征

Hp 是一种革兰阴性微需氧杆菌，具有单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌形态[13]。Hp 感染是胃十二指肠溃疡和胃癌的主要致病源[14-15]，其传播的途径主要通过粪-口、胃-口以及口-口传播[15-16]。Hp 不根除将引起终生感染，或可发展为胃癌[17]。Hp 感染的因素有细菌毒力、胃环境和宿主遗传成分。致病毒力因子有细菌定植因子血液抗原结合蛋白A（blood group antigenbinding adhesion,BabA）、唾液酸结合黏附素（sialic acid-binding adhesion, SabA）、外部炎症蛋白A（outer inflammatory protein, OipA）和外膜黏附素（HopQ）等，胃致病所需的毒力因子是效应蛋白，如细胞毒素-相关基因A（cytotoxin-associated gene A, CagA）、空泡型细胞毒素A（vacuolating cytotoxin A,VacA）等[18]。Hp 感染的前提是：Hp 在进入胃后可以借助其脲酶活性中和不利的酸性环境；随后，细胞利用其鞭毛介导的运动向胃上皮移动。之后，Hp 黏附素也进一步与宿主细胞受体相互作用，导致成功定植[19]。BabA 是Hp 释放的黏附素，能使Hp 免于因蠕动和胃排空等力而从胃中移位[20]。OipA 也是Hp 分泌的黏附素的一种。BabA 与OipA 呈现负选择关系，且OipA“on”型幽门螺杆菌较OipA“off”型菌株生长周期更快[21]。同样地，Hp SabA 的临床菌株也具有“开/关”状态，具体表现为当胃内pH 值降低时，SabA 的表达增加，这意味着SabA 可以快速调节以响应胃生态环境的变化[22]。

3 幽门螺杆菌导致EMT 的机制

3.1 细胞毒素-相关基因A

CagA 是Hp 菌株携带的一个功能性致病岛（CagA-PAI）的效应子，CagA+能损害细胞上皮的紧密连接，降解基底膜并形成伪足，与EMT 的发生过程高度相似[23]。关于Hp 的致病机制，一般说法认为是BabA 介导IV 型分泌系统（type IV secretion system, T4SS）的激活并促进毒力因子CagA 胃黏膜上皮细胞的易位；在此过程中，HopQ 可与癌胚抗原相关细胞粘附分子家族（the carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule family, CEACAMs）N端的IgV 样结构域结合，也促进CagA 向宿主细胞的转移[22]。

3.2 Hp 诱导的自噬和EMT 的关系

当Hp 暂时感染胃上皮细胞时， VacA 可诱导自噬，从而降解毒素，减轻细胞损伤，进一步维持细胞稳态；但长期感染后，会破坏自噬通路，进一步导致细胞内自噬功能障碍[24]。在幽门螺杆菌感染期间，胃上皮细胞中的自噬可以上调或下调[25]。首先，Hp能够通过减少自噬通量激活自噬过程；用自噬抑制剂处理受感染的细胞后降低了间充质表型的出现和与EMT 相关的迁移能力[26]。其次，在Hp 相关胃癌的进展中，CagA 诱导 miR-543 过表达靶向SIRT1以抑制自噬。随后可能会增加EMT 的表达，从而导致细胞迁移和侵袭[27]。这表明Hp 控制自噬时，可以由其他因素阻断，从而改变自噬的表达，抑制胃上皮细胞的间充质转变或胃癌转变。

3.3 CD44 受Hp 影响诱导EMT

CD44 是一个非激酶家族，其主要配体是透明质酸（hyaluronic acid, HA），它是由基质细胞和癌细胞表达的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的丰富成分[28]。过表达CD44 的细胞具有自我更新和EMT 能力，HA 能结合CD44 配体并结合结构域，诱导构象变化，使衔接蛋白或细胞骨架元件与细胞内结构域结合，从而激活各种信号通路，导致细胞增殖、黏附、迁移和侵袭[29]。

3.3.1 CD44 通过调控细胞信号通路对EMT 的促进作用 当Hippo 途径失活时，Hippo 通路效应子yes相关蛋白（yes-associated protein, YAP）和具有PDZ结合基序的转录共激活因子（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif, TAZ）不会被LATS1/2 磷酸化，减少在细胞核中积累并与转录因子结合的机会。Hp 感染则增加了TAZ 核表达和转录增强子TEA 结构域（transcriptional enhancer TEA domain, TEAD）的转录活性，而TAZ 沉默抑制EMT表型并降低了相关标志物ZEB1 表达[30]。Yong X等[31]发现，用细菌株11637（CagA-Hp）或缺乏CagA的11637 基因突变株感染胃癌细胞，使CD44 表达增加后，Hp 将以CagA 依赖性方式激活Wnt/β-catenin信号通路，使细胞中上皮标志物 E-cadherin 的表达出现降低，同时间充质标志物 N-cadherin、Vimentin等表达增加。同理，Tipα 在SGC7901 细胞中激活Wnt/β-catenin 信号诱导 EMT 并增加该信号传导的下游靶基因的表达；然而，XAV939（Tipα 的抑制剂）预处理能抑制Tipα 诱导的EMT[32]。另外，Hp 感染可能还会触发TGF-β1 诱导的EMT 通路的出现。根除它可能通过抑制此途径来预防胃癌的发生[33]。

3.3.2 CD44 通过骨髓源干细胞向癌症干细胞转变促进EMT Hp 的慢性感染会引起胃上皮黏膜的慢性炎症和随后的损伤，从而导致骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMDSCs）募集。慢性感染和炎症导致EMT、改变的组织再生、局部上皮干细胞和BMDSCs 的分化。EMT 诱导具有间充质和干细胞特性的CD44+细胞的出现，导致化生和发育异常病变，在可能出现的额外的表观遗传和突变事件后，最终引起CSC 和腺癌病变[34]。另外，此机制也间接说明Hp 通过CagA 通过诱导胃上皮细胞中的 EMT 样变化来揭示癌症干细胞（cancer stem cells, CSC）样特性[35]。相关学者证明只有培养的人胃上皮细胞的CD44+细胞可以被Hp 感染诱导呈现间充质表型。并且在小鼠异种移植模型中更具致瘤性[36]。

3.3.3 CD44 通过CSC 促进EMT 含有磷酸化功能EPIYA 基序的CagA 可以导致胃癌细胞间充质标志物Vimentin、Snail 和ZEB1 以及干细胞标志物CD44的转录活性显著增加，表明EMT 被CagA 蛋白通过EPIYA 磷酸化诱导[37]。CagA+Hp 感染HFE-145 细胞后，CDX1 以及EMT 标志物Snail 和Slug 的表达增加，但在感染 CagA-Hp 的 HFE-145 细胞中未发现这些影响。因此，CagA+是影响胃癌细胞EMT 的主要元凶之一[38]。此外，Snail、Twist 和ZEB 等EMT 相关标志物的表达属于癌症转移在疾病发展的早期阶段的表现，应该重视这些指标检测的重要性[39]。

3.4 肿瘤抑制因子、转录因子及微小RNA

3.4.1 程序性细胞死亡因子4 程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4, PDCD4）是一种肿瘤抑制因子，与胃癌组织恶性程度有关[40]。在Hp 感染所致的胃癌中，CagA 作为潜在的EMT 诱导分子，使PDCD4 和上皮细胞标记物E-钙粘蛋白在癌症标本中的表达降低[41]。南蛇藤茎中提取物（the extract of Celastrus orbiculatus, COE）抑制PDCD4 启动子的甲基化水平，使PDCD4 表达增加并调节EMT 过程，抑制Hp 诱导的炎症反应[42]。

3.4.2 肿瘤坏死因子α 诱导蛋白 TNF-α 诱导蛋白（TNF-α-inducing protein, Tipα）是幽门螺杆菌特有的致癌因子，能特异性地与细胞表面核仁蛋白结合，然后进入癌细胞[43]，已被确定为肿瘤启动子[44]。Tipα 能诱导较低的细胞硬度并导致较高的细胞运动性，诱导了MKN-1 细胞中Vimentin 的表达[44]。关于Tipα 与EMT 的讨论，有以下论点。首先，Tipα 与EMT 直接相关，以时间剂量依赖的方式调控Ecadherins、N-cadherins、Vimentin 表达，刺激细胞丝状伸长；同时，Tipα 可通过刺激炎症因子IL-6 产生，自分泌的IL-6 激活p-STAT3 信号，Tipα 通过IL-6/STAT3 通路促进胃癌细胞的EMT 和侵袭[45]。表面核仁素在Tipα 诱导MKN-1 细胞迁移能力中的影响也被提及，除Tipα 本身可成剂量依赖性诱导降低细胞硬度，诱导丝状伪足外， Tipα 诱导的细胞伸长受到了表面核仁素的调控；另外，核仁素能够激活MEK-ERK1/2 通路诱导EMT， Tipα 也能刺激MEK1 和ERK1/2 的磷酸化，使细胞产生EMT 表型变化[46]。 Tipα 诱导的ERK1/2 磷酸化也可以被BTG2/TIS21表达下调，但BTG2/TIS21能否抑制Tipα 进而抑制EMT，目前缺乏相关研究，还需要进一步深入探讨[47]。在Hp 中蛋白质Lpp20（Hp1456）部分结构与Tipα 相似，可以通过形成二聚体的方式降低Ecadherin 表达，促进胃癌细胞迁移[48]。此外，研究表明，Hp 中Hp0953 蛋白和Tipα 功能相似，且为胃部定植的Hp 特有，可能与胃癌的发生有关[49]。

3.4.3 含IQ 基元GTP 酶激活蛋白1 含IQ 基元GTP

酶激活蛋白1（IQ motif-containing GTPase-activating protein 1, IQGAP1）是一种与E-cadherin 相互作用的粘附连接的支架蛋白，可调节细胞可塑性和增殖。将转基因小鼠感染Hp 后， IQGAP1 表达量降低，将会促进间充质表型表达和CSC 样特性[50]，可能是Hp感染会诱导IQGAP1 和E-cadherin 从细胞-细胞连接处离域导致的。Hp 感染后显示E-cadherin 和重新分布到细胞内的位置，E-cadherin 在膜上的水平持续降低，减少了连结，会增加上皮的通透性，表明Hp 会降低黏附连接结构的功能[51]。虽然IQGAP1 mRNA 在膜上出现代偿性增高，但并未改变黏附持续减少的结果。

有理数一般通过整数、分数、有限小数、无限循环小数4种形式来考查．以下对两版教科书有理数例题中这4种形式例题的数量进行比较分析．

3.4.4 胃动蛋白1 胃动蛋白1（gastrokine 1, GKN1）是由胃上皮细胞分泌的抗炎蛋白，其表达的异常与恶性肿瘤前期炎症和胃癌有因果关系[52]。在感染Hp 的人或者鼠的胃上皮细胞和黏膜组织中转染了CagA 或GKN1 后， GKN1 过表达可以与CagA 结合成功地抑制CagA+明显诱导的细胞迁移和侵袭作用[53]。Koper-Lenkiewicz OM 等[54]人使小鼠肠黏膜损害后注射GKN1，发现在GKN1 的影响下，Occludins 的免疫反应性增加，形成紧密连接，增强结肠黏膜上皮细胞的附着。

3.4.5 基本螺旋-环-螺旋蛋白1/核转录激活蛋白家族1 主导控制样蛋白1（mastermind like transcriptional coactivator 1, MAML1）是Notch 信号通路的主要转录共激活因子，Twist 相关蛋白基因1（twistrelated protein 1, Twist1）是EMT 的调节因子，二者在肿瘤中常伴随表达[55]。在一项meta 分析中，73 个胃部肿瘤中有34 个（46.6%）检测出Hp 阳性。在这些Hp 阳性样本中，MAML1 和Twist1 的mRNA 表达水平之间存在明显的正相关（P＜0.001），且Hp 可通过破坏 Twist1/MAML1 表达模式和相关途径来增强胃癌生长和转移[56]。Hp 感染的胃腺癌样本中发现ETS2、Twist1、Siah2 表达上调，这可能是因为表达升高的ETS2、Twist 介导了Siah2 的转录， Siah2 表达量升高则促进了Hp 感染的胃癌细胞的侵袭和转移[57]。在胃癌恶性组织中，由于PDCD4 和Twist1 的表达量成反比，因此Hp 感染的胃癌细胞系中发现CagA 是通过抑制PCCD4 增加Twist1 的表达量调节EMT 的发生[41]。

3.4.6 CagA 与肿瘤抑制蛋白p53 的细胞凋亡刺激蛋白间相互作用 CagA 与肿瘤抑制蛋白p53 的细胞凋亡刺激蛋白（CagA-ASPP2）的相互作用是Hp感染后细胞极性缺陷的前提之一。通过ASPP2 的聚集作用，紧密连接的顶端Par 复合物ASPP2-Par3-aPKC 和基底外侧复合物Par1b 形成了异常连接，此时CagA 实现了使受到Hp 感染的上皮细胞失去极性，而干扰CagA-ASPP2 的相互作用可以通过抑制RTK/PI3K/AKT 通路给下游传导的信号来实现，抑制EMT 并降低Hp 在胃中的存活率[58]。

3.4.7 孕激素和脂肪Q 受体家族成员3 孕激素和脂肪Q 受体家族成员3（progestin and adipoQ receptor 3, PAQR3）是一种新发现的肿瘤抑制因子，其下调与胃癌患者的转移加速和预后不良密切相关[59]。PAQR3 过表达能够直接抑制胃癌细胞的细胞增殖、迁移和EMT[60]。通过调节TGF-β/Smad 信号通路，PAQR3 还显著抑制Hp 感染的HGC-27 细胞迁移和侵袭[61]。

3.4.8 微小RNA miRNA 在胃癌中的作用至关重要。在感染Hp 的人群中发现miR-29a-3p 可以调控胃上皮细胞的变化，这可能是通过直接靶向胃上皮细胞中的A20 基因实现的，此过程促进了Snail、Vimentin 和N-cadherin 的表达，同时抑制E-cadherin的表达[62]。抑制胃上皮细胞miR-21/PDCD4 信号通路后，可以使COE 通过调节EMT 进而抑制Hp 诱导的炎症反应[42]。另外，miR-134 可能通过靶向FoxM1 抑制受Hp 感染的SGC-7901 细胞的侵袭和EMT[63]。

3.4.9 Hp 60190 株及其等基因突变株 在 MKN-45 细胞中， CagA 能够增强雌二醇对HOTAIR 的促进作用，进一步促进EMT，但通过与选择性ER 降解剂氟维司群共同处理可逆转[64]。与非致病菌株相比，Hp 致病菌株显著上调所有3 种胃细胞系中的EMT 相关基因Snail、Slug 和Vimentin。胃泌素和MMP-7 siRNA 和MMP-7 中和抗体显著抑制了Hp感染的胃细胞系中可溶性肝素结合表皮生长因子（soluble heparin-binding epidermal growth factor, HBEGF）表达减少，并降低了EMT 基因表达。胃泌素siRNA 也逆转了Hp 对 EMT 的影响[65]。

4 幽门螺杆菌感染后相关信号通路的激活与EMT

在一些报告中，Hp 能通过T4SS 激活NF-κB，而CagA 本身也能依靠RAS-MAP 激酶信号通路激活NF-κB，由此诱导了IL-8 的上调表达，引发炎症反应与EMT[23,34]；另一方面，在进入宿主细胞后，磷酸化的CagA 能够与宿主细胞质内的酪氨酸磷酸酶SHp-2 产生相互作用，产生不同于前的炎症反应，并促进胃癌发展[66]。

4.1 NF-κB 通路

Hp 菌株和间充质干细胞共培养产生的上清液不仅具有促EMT 作用， 其中NF-κB-p65 磷酸化、IL-6 的表达水平也显著升高[67]，表明Hp 能通过NF-κB 通路诱导GC 细胞EMT、侵袭和转移。一项关于Hp 的芯片数据和IκB 转染实验也证实了在受感染的胃AGS 细胞系中，NF-κB 被Cag-PAI+Hp 激活后，激活了ZEB1，NF-κB 又反式激活细胞中包含Vimentin 和Snail1 在内的EMT 效应器[68]。动物实验表明，大鼠的成纤维细胞的活化可以直接通过Hp 产生的CagA 发生，间接通过TLR2 和TLR4 发生，并导致EMT 标志物Snail 的快速表达，这是通过转录因子NF-κB 和STAT3 信号传导介导实现的[69]。

4.2 TGF-β/Smad 通路

4.3 PI3K/AKT 信号通路

多数研究表明，发生了EMT 的肿瘤细胞侵袭能力增强，其主要机制与PI3K/AKT 信号通路活化引起的细胞黏附能力下降密切相关[72]。生信分析与实验证明，TREM2 与胃癌中的Hp 感染状态密切相关，TREM2 可能通过抑制PI3K 和AKT 的磷酸化，调控PI3K/AKT 信号通路促进GC 细胞EMT 进展[73]。另外，Yoon JH 等[53]人证明CagA 诱导了AGS 和HFE-145 细胞以及CagA 阳性人黏膜中的p-AKT 上调，这种现象与EMT 密切相关。虾青素通过阻止Hp 刺激的细胞中PI3K/AKT/mTOR/NF-κB 的激活，抑制了MMP-7 和MMP-10 的表达，以剂量依赖性阻滞EMT 的进程[74]。Wang Z 等[75]发现，Hp 的毒力因子γ-谷氨酰胺转移酶通过消耗胃中的谷氨酰胺，减少三羧酸代谢物α-酮戊二酸，使间充质干细胞迁移到胃部，激活PI3K-AKT 信号通路，促进了间充质干细胞的迁移、自我更新和多能性。感染Hp 后，GSK-3β 通过Ser9 位点的发生磷酸化而失活，然而，通过PI3K/AKT 通路抑制其磷酸化，即可抑制Snail表达[76]。

4.4 Hippo 信号通路

Hippo 通路在器官大小控制以及组织的生理和病理过程中起着关键作用。其下游效应器YAP1 和TAZ 接收上游刺激并发挥转录活性[77]。原因可能是TAZ 通过Hippo 通路调节ZEB1 表达，同时也诱导了CagA 阳性Hp 的EMT 程序，且后续实验证明，Ecadherin 的下调使细胞更易于过度表达ZEB1 并产生EMT 变化[30]。Molina-Castro SE 等[78]也证明了在CagA 的刺激下，LATS2 及其底物YAP1 激活了Hippo通路，具体表现为LATS2 的表达能促进胃上皮细胞系表达基底上皮表型并抑制Hp 促EMT 作用。另一文献也表明，CagA 的敲除减弱了Hp 对YAP 的激活作用，使Hp 诱导的EMT 受到抑制[79]。

4.5 JAK/STAT 信号通路

Hp 释放的CagA 可以促成大鼠胃成纤维细胞的激活或者分化，这些作用由转录因子也可以通过STAT3 信号介导，导致Snail1 蛋白快速表达[69]。Tipα 能显著上调SGC7901 细胞中EMT 相关标志物的表达，同时激活IL-6/STAT3 信号通路促进EMT，从而加速胃癌的肿瘤侵袭性[45]。

4.6 Wnt2/β-catenin 信号通路

MNNG 和慢性Hp 感染协同作用促进了GES-1细胞和小鼠胃黏膜侵袭和迁移的增强、EMT/间充质表型的增加，同时，Hp 感染或MNNG 诱导作用还引起Wnt2 和β-catenin 的表达和激活增强。总之，这些发现表明慢性CagA+幽门螺杆菌感染与MNNG 刺激可以协同并诱导胃黏膜上皮细胞的间充质样特性[80]。

5 其他

Afadin 蛋白水平在幽门螺杆菌感染的两种不同细胞系中出现降低，而EMT 的指标（如ZEB1、Vimentin 等）表达增加。RNAi 对Afadin 的沉默促进了EMT 进程，这可能导致胃癌的发生[81]。 Hp CagA+VacA+菌株通过上调ZEB1 转录Claudin-2、CDX2表达促进AGS 细胞侵袭，姜黄素正丁醇提取物可以通过抑制以上标志物的表达来抑制其对AGS 细胞的影响[82]。溶酶体相关蛋白跨膜4β（lysosomalassociated protein transmembrane 4β, LAPTM4B）的下调也可抑制胃癌细胞的侵袭EMT[83]。非受体酪氨酸激酶c-Abl 在pAblT735 与14-3-3 蛋白相互作用下，在细胞之中出现了滞留，从而增强了Hp 介导的细胞伸长和迁移[53,84]。

6 小结与展望

侵袭和转移是恶性肿瘤的重要特征，而EMT促进了这一重要过程。在对幽门螺杆菌的研究中，目前已发现Hp 参与了EMT 并具有促进EMT的作用。Hp 感染宿主后，会通过T4SS 的激活引发CagA 的易位，并进一步推动EMT 进展。此过程关系到多个通路和因子，本文主要从自噬及信号通路方面总结了Hp 对于EMT 的作用，但仍有一些机制尚未明确。在今后的研究中可以在c-Abl、LAPTM4B 等方面进一步深入研究以更确切地了解其机制，相信随着对其深入探讨，这一机制可为胃癌发生、发展以及对胃癌的临床治疗提供新的思路和药物靶点。