结核分枝杆菌复合群检验中应用荧光定量PCR方法的临床价值

王强

长春市传染病医院检验科，吉林长春 130000

结核病是危害公共卫生健康安全的疾病，及早诊断对于疾病传播的预防具有积极作用，临床诊断结核病的方式，主要以实验室培养为主，该种检查方式需较长时间才能得出结果，具有检验效率低、不能够实施大数据筛查、诊断效果欠佳的特点[1]。随着各种结核分枝杆菌复合群检测方法的不断涌现，包括涂片法、固体培养法、恒温扩增法等，选择适合不同实验室条件、准确度高、性价比高的一种检测方式十分必要，实验室进行诊断技术选择时，需要综合考虑实验室条件、时效性、试剂成本、操作依从性等，选择最适合的结核病诊断技术[2]。荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）法可以对结核分枝杆菌复合群实际状态进行有效鉴别，具有较高的灵敏度和特异度，对于临床诊断和治疗，具有更科学的指导意义[3]。基于此，本文选取2022年3月—2023年5月在长春市传染病医院治疗的118例疑似结核患者进行研究，探讨荧光定PCR方法对结核分枝杆菌复合群的检验效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取在本院诊治的118例疑似结核患者作为研究对象，男60例，女58例；年龄20～68岁，平均（41.17±7.26）岁。共计156份临床样本。本研究的开展已经获取医学伦理相关组织的审批，患者已了解本研究实施过程和目的，签订了同意协议。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①年龄≥18岁患者；②资料没有缺失情况患者；③配合良好，能够完成本研究患者；④无精神疾病史患者；⑤无智力障碍，可正常沟通患者。

排除标准：①未留取标本患者；②痰标本剂量不足2 mL患者；③标本属于唾液痰患者；④近1个月内进行抗结核治疗超过2周患者；⑤中途退出研究患者。

1.3 方法

实验室培养：将样本进行前处理，之后放于改良罗氏培养基内进行培养。

荧光定量PCR检测法：将样本进行离心处理，取沉淀后灭活，再于室温下进行离心处理，之后加入结核杆菌复合群核酸检测试剂增强液于样本，经提取仪提取核酸。加入TB-DNA提取液于待测样本和阴阳对照品，分装于8联管孔上SLAN-96SPCR扩增。仪器PCR反应程序：先通过50℃UNG处理，维持2 min，再利用95℃UNG酶失活，预变性10 min，再Touchdown循环程序10个，PCR循环程序45个，再按照标准曲线对CT值进行计算。所用仪器分别为SLAN-96S核酸扩增仪，结核分枝杆菌培养仪BD BACTECMGMT960，培养管批号为国械准进20142405711，结核分枝杆菌复合群核酸检验剂批号为20112601。

1.4 观察指标

对患者检测结果进行观察分析，以实验室培养为金标准，分析荧光定量PCR法的检验准确度、灵敏度和特异度。准确度=（真阴例数+真阳例数）/总例数×100%；特异度=真阴例数/（真阴性例数+假阳例数）×100%；灵敏度=真阳例数/（真阳例数+假阴例数）×100%。

1.5 统计方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计数资料以例数（n）和率（%）表示，进行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在118例疑似结核患者中，共计156份临床样本。156份临床样本经实验室培养检查确诊患者104份，占比66.67%，荧光定量PCR法阳性检出率为64.10%（100份），和实验室培养检查结果相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；临床样本荧光定量PCR法检测的准确度、特异度、灵敏度分别为97.44%、100.00%、96.15%，见表1、表2。

表1 两种方法阳性检出率比较

表2 荧光定量PCR法诊断结果（n）

3 讨论

结核病为传染性疾病，全球人口流动性提升，导致结核病发病率随之提高，我国是结核病高发国家，活动性肺结核患者人数占据全球第二，且传染性肺结核患者人数较多，防治结核病为我国临床研究的重点[4-5]。自抗结核病治疗方案使用之后，耐药、耐多药结核病发生率逐渐提高，且存在双重感染（人类免疫缺陷病毒以及结核分歧杆菌）风险，加之全球人口流动性的增强，导致结核病发生率逐渐提升，在欧美国家也发生了反弹情况。世界卫生报告组织调查表明，世界上感染结核杆菌的人数＞20亿，其中活动性肺结核患者人数多于2 000万，每年新增该疾病患者的人数多于300万，而我国属于结核病高发国家，其中活动性肺结核患者人数居于世界第二，据我国流行病调查结果表明，我国活动性肺结核患者数量多于600万，传染性肺结核患者数量在200万之上，因此防治结核病成为医学研究重要课题[6-7]。

结核病检测方法主要包括直接涂片镜检、病原学培养，其中，涂片镜检以萋-纳氏抗酸染色法为主，该种检测方式简单易操作，无需特殊设备，是该疾病病原检查最基础的方法，但此种方法具有较低的敏感性；而病原学诊断中，细菌培养法为诊断金标准，但该种检验方式检验用时久，易延误疾病治疗的最佳时机，且会导致疾病传播，其最大的问题即结核分枝杆菌生长周期长[8-9]。除上述两种检测方法外，单克隆抗体也能够检出结核分歧杆菌特异抗原，进而达到诊断目的，但该种检测方式对于痰液、胸腹水标本的检测效果并不理想，假阳性、假阴性率较高，诊断结果并不可靠。为提升结核病诊断结果，需采取更加有效的检验方式。

荧光定量PCR法是一种常见的检验方式，检验模式为决定定量、相对定量，前者通过已知标准曲线计算样本量，后者通过靶序列对于另一组参照序列变化信息计量。荧光定量PCR方法目前已被临床医学广泛使用，对于（人类免疫缺陷病毒、人类疱疹病毒、巨细胞病毒以及结核杆菌等病原体检测均具有良好检验效果[10]。在多种病原体的诊断中，均能够使用PCR技术，如结核杆菌、布鲁氏菌，且相关研究证实，使用PCR方法诊断结核性脑炎，可获取结核分枝杆菌培养法和直接涂片法所无法比拟的敏感度[11-12]。荧光定量PCR技术指的是PCR反应体系内加入荧光基团，通过荧光信号累积，对整个PCR进行实时监测，最终利用标准曲线定量分析未知模板，该项技术将定时定量PCR仪、实时荧光定量试剂、通用电脑以及自动分析软件结合起来，形成了PCR-DNA、RNA实时荧光定量检测系统[13]。传统PCR技术不能准确定量，操作当中容易受到污染，存在较高的假阳性率，应用受限，因此准确定量PCR产物是PCR技术的重要发展方向。荧光定量PCR技术采用全封闭反应，可以避免污染问题产生，且该种方法特异度和灵敏度更高，通过实时监控能够更加精准地定量检测，从而为疾病监测提供参考[14]。王纯华等[15]研究中，荧光定量PCR检测肺内样本检测中灵敏度与特异度分别为97.8%、97.5%，其数据均具有较高的检测准确性；本研究中，临床样本荧光定量PCR法检测的灵敏度、特异度分别为96.15%、100.00%；本研究临床样本荧光定量PCR法检测结果与其研究具有一致性，说明其检测方式具有较高的准确度，由此可见荧光定量PCR方法存在良好的检测效果，可以提升临床诊断准确率，利于患者疾病的有效治疗，对患者治疗和预后均具有积极意义。

综上所述，荧光定量PCR方法检测结核分枝杆菌复合群，可获取较高的灵敏度和特异度，其检验准确度与实验室培养结果相当，利于患者尽早治疗，改善预后。