高毒力肺炎克雷伯菌毒力影响因素及分子流行病学研究的进展

谢铌奇，王杉，胡铁弋

重庆市大足区人民医院检验科，重庆 402360

肺炎克雷伯菌（klebsiellapneumonia, KPN）是一种重要的革兰阴性杆菌，可引起多种感染性疾病，如尿路感染、肺炎等[1]。高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent klebsiella pneumoniae, HvKP）感染首例报道来自我国台湾地区，是一种不同于经典肺炎克雷伯菌（classic klebsiella pneumonia, cKP）的侵袭性感染[2]。HvKP毒性更强，其不仅可以在健康人群中传播并引起危及生命的侵袭性感染，如眼内炎、化脓性肝脓肿等，且伴有扩散转移[3]，危及生命。HvKP的发病表现出一定的地域特点，这可能与不同地区、不同种族的人群肠道或鼻咽部HvKP携带率及血清型不同有关，如一项研究表明23%的华裔健康人群肠道中有K1、K2血清型肺炎克雷伯菌定植[3]，而西班牙败血症患者分离的肺炎克雷伯菌中也仅有2.8%为K1、K2血清型[4]。HvKP在发现初期对抗生素普遍比较敏感，近年来发现耐药率有上升趋势，耐药HvKP的发展使防治工作变得更加被动，甚至有HvKP院感爆发并致多人死亡的案例报道。为研究HvKP高毒的原因，了解耐药率发展趋势，以对临床治疗、院感防控、耐药监测及后续的研究方向提供理论基础，本文对HvKP研究现状进行了归纳总结。

1 HvKP的临床特征研究现状

1.1 临床症状和感染途径

HvKP造成的感染往往是侵袭性的，除了肺炎、伤口感染等，也可引起坏死性筋膜炎、心内膜炎、骨髓炎、眼内炎等。HvKP常可通过多种途径引起既往体健和年轻患者严重的社区获得性感染。如通过微吸或大吸口咽定植HvKP引起肺炎；结肠、会阴的定植菌可通过上行途径导致肝脓肿或尿路感染；在医疗环境中，黏膜或上皮屏障的破坏（如气管内管、手术切口和导管）也可能导致HvKP进入机体引起感染。有研究发现，HvKP感染者比普通肺炎克雷伯菌感觉者更容易出现肝区疼痛、寒战高热、恶心呕吐等症状，且发生病死率和合并糖尿病的概率更高[5]。如相关研究报道了在1例HvKP引起的全身侵袭性感染病例中，该患者有糖尿病病史。

1.2 临床诊断

目前诊断HvKP最普遍的方法是细菌培养结合临床特征。细菌培养后通过拉丝实验鉴别HvKP和普通肺炎克雷伯菌。最初认为高黏性表型对于判断菌株是否为HvKP具有敏感度和特异度，即当用接种环来拉伸琼脂板上的菌落时，形成长度为5 mm的黏液丝，也称为拉丝实验阳性。

但事实证明并非所有HvKp菌株都是高黏的，一些cKp菌株也可能具有这一特征。所以研究者们试图通过一些基因或载体的测定来判断菌株是否为HvKP，如有研究表明毒力基因peg-344、iroB、iucA、prmpA、prmpA2和铁载体产量＞30 g/mL可用来区分HvKp与cKp菌株[2]。

1.3 临床治疗与预后

目前对于HvKP的治疗主要包括抗生素治疗和外科干预。具体的治疗方案取决于医生对病情的评估，主要根据感染部位及严重程度进行评估，如脑、硬膜外间隙等危险部位或已经破裂的脓肿应考虑立即进行手术。肝脏等部位的脓肿则根据脓肿大小决定治疗方案，＞5 cm的肝脓肿一般采取大口径导管引流或切开引流，甚至同时进行肝切除，对于较小的脓肿，也可根据情况仅使用抗生素治疗。

2 HvKP的毒力影响因子

2.1 荚膜

2.1.1 荚膜多糖 荚膜是肺炎克雷伯菌最外层的结构，是造成HvKP黏液表型的重要原因，主要成分是荚膜多糖。其具有很强的防御功能，包括粘附、形成生物膜、抗中性粒细胞吞噬作用，抑制抗菌肽（人β-防御素、乳铁蛋白），抑制补体的杀伤和抑制炎症反应，如活性氧（reactive oxygen species, ROS）、白介素-6（interleukin-6, IL-6）、白介素-8（interleukin-8,IL-8）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等炎症因子下降。故荚膜多糖产量增多是造成HvKP高毒性的重要原因之一。HvKP高毒力的遗传决定因素通常存在于大毒力质粒（plasmid-LVPK, p-LVPK）和染色体可移动遗传元件上。cpsB与cpsG等基因负责多糖的合成[6]，位于毒性质粒p-LVPK上的黏液表型调节基因A（regulator of mucoid phenotypegene A, rmpA）/rmpA2[7]通过调控染色体上的荚膜合成基因cps的表达从而调控荚膜多糖的产量[8]，另外荚膜合成基因rcsA、rcsB的上调也是造成荚膜多糖合成增加的原因。2004年首次报道的毒力基因magA一般位于染色体上[7]，编码荚膜组装过程中的重要蛋白。

2.1.2 荚膜血清型 由于荚膜相关等位基因wzi的核酸序列不同，荚膜多糖的成分各不相同，根据荚膜多糖的成分不同，可将肺炎克雷伯菌分成不同的血清型。目前确定的血清型至少有134种，HvKP最常见的血清型有K1、K2、K5、K20、K54、K57，其中K1、K2最为常见。这些血清型高毒的原因可能是由于荚膜成分缺少巨噬细胞吞噬病原体时与细菌表面结合所需的糖分子（如病原体表面重复的甘露糖或鼠李糖）[9]。

2.2 菌毛

菌毛是细菌外部的突起，有助于细菌的粘附和定植，故也是细菌重要的毒力因素，肺炎克雷伯菌主要有Ⅰ型和Ⅲ型两种菌毛。Ⅰ型菌毛为线状突起，编码基因是fimB，能定植于尿道和膀胱，与尿路感染密切相关。Ⅲ型菌毛为螺旋状细丝，由mrk-ABCDF基因编码，与K2血清型密切相关，主要介导导管相关感染。

2.3 脂多糖

也叫做内毒素，是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，由脂质A、O抗原与核心多糖构成，其中O1型是HvKP最常见的O抗原，可阻止补体与细菌结合[10]，如阻止补体C1q与细菌结合，从而抑制补体途径的激活[11]。wabG和uge等基因与脂多糖相关[12]。

2.4 铁摄入系统

铁对于细菌新陈代谢至关重要，但细菌自身不合成铁，需从外界摄入，故铁摄取系统是细菌重要的毒力分子机制，铁载体作为一种低分子量的铁螯合剂是细菌从外界摄取和转运铁的蛋白，有研究证明HvKP比cKP产生更多的铁载体，总铁载体产量与菌株的毒力大小密切相关。肺炎克雷伯菌合成4种铁载体：肠杆菌素、耶尔森菌素、沙门菌素、气杆菌素[13]。编码铁载体的基因主要有kfuBC、iucB、aer、iroNB等。HvKP中气杆菌素最多，占80%～90%，由iucABCD-iucA基因编码，有研究证明气杆菌素能显著提高细菌在人腹水、血清等体液及小鼠全身及肺部等组织中的存活率[14]。宿主产生铁载体结合蛋白脂质运载蛋白2，阻碍铁的获取而抗菌。沙门菌素是高度糖基化的肠杆菌素，能逃逸脂质运载蛋白2的结合，主要通过调控iroA基因簇和iroBCDE，所以携带沙门菌素的肺炎克雷伯菌，更容易在鼻咽部定植[8]。

2.5 其他毒力因素

菌株序列类型和毒力质粒也是重要的毒力因素。通过全基因组测序发现，HvKP来的序列大多为ST11、ST23、ST65几种类型，序列类型通常与血清型之间存在一定的关联，ST23型菌株绝大多数为K1血清型，肝脓肿患者的脓液标本中分离菌株常为此种类型。ST65型菌株大多为K2血清型，与各种侵袭性感染相关。HvKP的毒力基因位于染色体、共轭元件、毒力质粒上，目前发现的毒力质粒主要有pLVPK、pK2044等，rmpA、rmpA2、iro、iuc、peg-344等重要的毒力基因位于毒力质粒上，所以毒力质粒对于HvKP的高毒因素至关重要。

3 流行病学及分子流行病学研究现状

3.1 血清型差异

不同地区HvKP的荚膜血清型存在很大的区别，其中K1和K2型在亚洲地区最为常见而在欧美地区不常见。这可能也是造成HvKP地理分布差异的原因。

3.2 分子流行病学研究现状

由于各地HvKP的感染情况各不相同，对当地HvKP菌株进行分子流行病学研究成为一种必要。各地学者常通过药敏试验、毒力基因和荚膜血清型检测及多位点序列分型（multilocus sequence typing, MLST）分析进行研究。如金晓立等[15]研究了HvKP菌导管相关血流感染的菌株荚膜血清型和MLST，发现引起导管相关败血症的HvKP菌株相比cKP对多数抗菌药物耐药率较低，其荚膜血清型分布以K1、K2为主，MLST分型以ST23、ST86、ST65为主。另一研究显示腹腔感染患者分离的KPN中，HvKP的荚膜血清分型以K1型为主，毒力基因以peg-344和icuA为主（61.9%、54.6%）。徐水宝等[16]研究了某3家医院侵袭HvKP，发现HvKP组中以K1血清型为主，总体上HvKP组的毒力基因阳性率较cKP组更高，尤其是rmpA2、magA、fimH、aero iutA、kfuBC。

4 HvKP的耐药机制

4.1 HvKP耐药机制

HvKP在发现初期除了对氨苄西林和替卡西林天然耐药以外，对其他抗菌药物普遍比较敏感。然而，随着广谱抗菌药物的使用，耐药率逐渐升高并出现了多重耐药的HvKP。这可能与质粒或可移动元件的水平转移有关：一方面，HvKP获得了耐药质粒或含有耐药基因的结合元件转移到HvKP内部并整合于染色体上造成HvKP的高耐药性。另一方面，多重耐药的cKP也能获得毒力质粒从而变成高毒力的耐药菌株。另外，HvKP外排泵系统的激活也是HvKP耐药的原因。

4.2 高耐药HvKP的种类

4.2.1 产超广谱β内酰胺酶的HvKP（extendedspectrum β-lactamases-hypervirulent klebsiella pneumoniae, ESBLs-HvKP） β内酰胺酶如AmpC能水解头霉素造成细菌对头孢类药物耐药，超广谱β内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases, ESBLs）是一种经修饰的β内酰胺酶，可水解一代至三代头孢菌素及部分四代头孢菌素、单酰胺类抗生素、青霉素等造成耐药。ESBLs-HvKP是最常见的多重耐药HvKP，菌株携带blaCTX-M、blaTEM等基因，产生CTX-M、TEM、OXA等种类的ESBLs。

4.2.2 耐碳青霉烯的HvKP（carbapenem resistance-HvKP, CR-HvKP） 我国CR-HvKP检出率也相对较高，如2014—2017年我国58%的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem resistance-klebsiella pneumoniae, CRKP）携带毒力编码质粒，其中13%的CRKP菌株表现出高毒力表型[17]。如一项针对宁波地区收集的150例HvKP的研究中，发现CR-HvKP占比高达9.33%[18]。菌株对碳青霉烯类抗生素耐药是由于细菌产生了KPC、OAX-48、NDM等类型的碳青霉烯酶，CR-HvKP产生酶的种类不同其高毒耐药融合机制也不一样。刘岩等[19]收集江西省11个地级市3年分离的CRKP共749株进行研究，发现CR-HvKP共126株（占比16.82%），以K64型为主（占比88.10%），ST分型均为ST11型，CR-HvKP所携带的耐药基因大多为blaKPC（占比80.91%）。有研究发现，我国CR-HvKP主要携带blaKPC-2耐药基因，产生KPC-2型碳青霉烯酶[20]。序列类型主要为ST11、ST65，可能原因为CR-cKP获得了pLVPK样毒力质粒。

4.2.3 其他耐药类型的HvKP 如多粘菌素或替加环素耐药菌株的发现使HvKP的防治难度进一步加大，多粘菌素是治疗多重耐药革兰阴性杆菌的最后一道防线，造成耐药可能的原因是携带耐药基因mcr-1的质粒在细菌之间的水平传播，具体的机制及治疗措施还不明确，仍需进一步的研究。

4.3 多重耐药HvKP的防控措施

耐药使得HvKP的治疗尤为棘手，国内外均有院内感染造成多起死亡病例发生的案例，如2019年发生于温州某医院重症监护室的HvKP院内感染，造成8位患者死亡，病死率为100%。因此，多重耐药HvKP的防控一定要严格遵守当地院感防控政策，主要表现在检验科微生物室及时出具报告并作为危急值报告临床科室，随后医生下解除隔离医嘱，护士执行医嘱并进行环境消毒，同时应对该科室的环境卫生、医务人员手卫生等进行定期的监测。院感科应定期对该地区或医院检出的菌株进行耐药率分析、报告。

5 结语

综上所述，通过不断对HvKP的研究，很大程度上了解了HvKP的临床特征，毒力因素及相关机制，并提出了一些诊断方法。目前常见的诊断方法主要是临床症状结合拉丝试验、基因检测、铁载体含量测定等。但由于目前尚未有一种公认的精准诊断HvKP感染的方法，所以研究仍需进行。一方面，需要进一步研究HvKP的毒力机制，寻找准确快速诊断HvKP的方法，提高HvKP的治疗效果；另一方面，各地区也需要进行分子流行病学的研究，为各地区的防治工作提供理论依据，减少耐药菌株的产生。