耐喹诺酮类肠球菌耐药机制研究

郭丽娜

内蒙古包头医学院第二附属医院检验科,内蒙古包头 014030

目前， 抗菌药物在临床中的使用面积越来越广泛， 但是抗菌类药物的长期使用会诱发耐药性的问题，对于整体的治疗效果造成极大影响，这也是医学界不得不重视的一项严峻问题。 在临床中，细菌耐药性产生的过程十分复杂,肠球菌也不例外。 在临床中如果对其机制展开深入研究，将帮助临床工作者通过多渠道逆转细菌耐药性问题,从而使抗菌药物更好地服务于临床，并以此为依据开发出各类新药。 从当前的研究来看，喹诺酮耐药机制主要包括特异性和非特异性，不过目前肠球菌对喹诺酮耐药性的问题形势严峻；为了更好地合理应用抗生素，医务人员必须坚持对抗生素耐药性的监测， 同时掌握细菌耐药性的变迁，以此来探索耐药机制，这也是抗菌类药物合理应用的根本途径。

1 研究喹诺酮类抗生素耐药问题的背景

在临床中可引起感染的病原菌较多，其中大肠埃希菌是极其常见的一种细菌。 据有关研究统计，目前全球大约每年有超过6 亿的人口因大肠埃希菌而发生感染，甚至导致＞80 万的患儿死亡，所以这种病菌对于人类健康的威胁极大，而且感染面积较广，因此必须选择一种可以广泛应用，且杀菌效果极佳的抗生素药物进行治疗。 不过单纯从耐药性角度分析来看，实际上大肠埃希菌在抗生素未发现前便已经有耐药性，这一研究结果早在1940 年便已经得出，这也说明耐药性的产生原因不仅仅和抗生素药物的广泛使用有关，与此同时也可能在对抗恶劣环境中产生[1]。 不过在未使用抗生素的前提下就产生耐药性，仅仅会出现在个别细菌中存在，整体而言比较少见。一般来说，耐药性大多由抗生素引起。 20 世纪60 年代时，临床中又发现了多重耐药性大肠埃希菌，这一现象也明确指出，每推出一种新药便会出现相应的耐药菌株，尤其在大肠埃希菌中，这种更新换代的特征极其鲜明。 等到80 年代，诺氟沙星广泛应用后，临床中出现了一批大量含类氟的氟喹诺酮类衍生物，因为该药物抗菌能力较强，因此在应用方面得到很大推广，这也是近年来对抗大肠埃希菌疗效最突出的一种药物。但是随着此类药物的广泛应用， 尤其很多不合理抗生素滥用，致使临床中出现很多多重耐药性大肠埃希菌，因此喹诺酮类药物的耐药性问题也在逐渐加剧。

2 喹诺酮类抗生素耐药现状

奎诺酮类药物从发布以来得到广大临床医师认可，其疗效同样极其显著，而近年来因为该药物应用面积逐渐扩大，因此耐药性的问题日益严峻。 以肠球菌为例， 当前世界范围内已出现不同程度的耐药菌株，其中台湾大肠埃希菌对喹诺酮药物的耐药率高达20%左右，美国高达10%，在中国则高居全球首位。通过以往的相关报道来看， 我国从1994 年开始统计大肠埃希菌对喹诺酮类药物的耐药率，当时大约维持在50%左右，但是翻看近几年的报道，我国部分地区甚至超过70%[2]。 同样需要注意的一项问题是，在临床中很多新上市的喹诺酮类药物在应用初期时虽然耐药率较低，但是在应用数年后，同样也会出现耐药菌株，而且整体的耐药率增长极快。 面对这一严峻的耐药现状，当然与抗生素的广泛应用密不可分，同时该药物在治疗呼吸系统感染疾病时效果极其显著，因此喹诺酮类药物的销售趋势常年呈增长状态， 到2010年时，喹诺酮类抗生素在全国的销量已明显超过头孢类抗生素，在抗菌药物市场中占据着重要份额，也正是在这种滥用的背景下， 使得耐药性问题层出不穷。而且大量的新药不断研发使得新的耐药问题也在不间断地产生。 另外还需要注意的一点是，喹诺酮类药物在我国除了用于医疗外，还被应用到消毒、畜牧等行业，因此波及的面积极为广泛。

3 喹诺酮对细菌的作用机制

早在20 世纪70 年代时， 国外学者便发现DNA消旋酶，在通过一系列大量的科学考察后，以大肠埃希氏菌为例， 该病菌的DNA 消旋酶可以被萘啶酸抑制。 然后将萘啶酸耐药菌进行分离，单独取出该病菌的DNA 消旋酶后发现对于萘啶酸具有一定的耐药性。 因此在后续的医学研究中指出，诺酮类药物产生耐药性的作用靶位便为DNA 消旋酶。 直到20 世纪90 年代，克隆出拓扑异构酶IV 基因，同样在类似的临床研究中表明， 拓扑异构酶IV 基因可以被喹诺酮类抗生素抑制，说明喹诺酮类抗生素对大肠埃希氏菌感染有治疗作用， 同时也可以得出拓扑异构酶IV 是喹诺酮类药物的靶位[3]。

4 药物靶位-拓扑异构酶II 的改变

4.1 DNA 促旋酶和拓扑异构酶IV 变异

扑异构酶 IV 的 ParC 和 ParE 分别与 DNA 促旋酶的GyrA 和GyrB 亚基同源。 而在粪肠球菌中，任何一项基因发生突变都会影响喹诺酮与靶位的结合，这也是耐药性问题无法得到妥善解决的重要因素[4]。 例如大肠埃希氏菌在靠近GyrA 基因的5’端时会出现高度保守区域， 该区域也与喹诺酮类药物耐药性有紧密关系，在医学中被称之为喹诺酮类药物耐药性决定区。

4.2 喹诺酮抗菌药程度和靶酶变异的关系

在肠球菌中， 其耐药性水平和DNA 促旋酶以及拓扑异构酶有直接关联，并且取代数目增加，那药性随之也会发生增高。在程健恒等[5]人的研究中指出，42株粪肠球菌仅携带有ParC 单位点氨基酸改变的临床株。 进一步研究时发现， 环丙沙星的MIC 值大约在1.52～3.30μg/mL，与此同时携带有 GyrA 和 ParC 的双位点突变临床株， 对应的 MIC 值为 30～90μg/mL，从这一研究中可以看出， 后者的数值是前者的几十倍。另外在章卓亮等[6]人的研究中也发现，在对18 株屎肠球菌进行研究，其中17 例出现突变位点。环比沙星的MIC 值大约为 8 μg/mL， 其余菌株均携带 GyrA 和ParC 双位点突变，相应的 mic 值为 32～249 μg/mL，也是前者的数十倍之高。

4.3 喹诺酮耐药程度和靶酶关系

喹诺酮与靶酶间的关系具有选择性，用药后会选择具体与哪一种酶为主要靶酶，实际上需要参考的因素众多，例如结构、药敏反应等，与此同时，对于耐药性也会产生直观影响[7]。而在大量的研究中也发现，对于较高水平的耐药性，往往需要两种靶酶同时发生突变才可能生成，因此概率相对较小[8]。从这一研究中可以发现，一般在药物中、低浓度便发生突变的酶，是首要靶位；反之则为次要靶位。 而革兰氏阴性菌主要靶酶为DNA 消旋酶；阳性菌中则为拓扑异构酶IV。 龙永艳等[9]人对粪肠球菌的研究中发现非基因突变的临床株对于喹诺酮类抗菌药的耐药水平有很大影响，观察中还发现MIC 值介于无突变株和同时存在GyrA和ParC 基因突变株之间， 这说明在粪肠球菌对喹诺酮类药物耐药性中，拓扑异构酶IV 是首要靶位。

4.4 喹诺酮结构和靶酶的关系

在肠球菌选择具体何种酶作为首要靶酶时，实际上与抗菌药结构方面的关系十分密切，因此不同药物结构作用的靶酶，也会存在一定差异[10]。 如左氧氟沙星主要靶酶为DNA 促旋酶；同样有研究指出，环丙沙星在用于治疗屎肠球菌时， 诱发ParC 基因突变的概率更高，说明主要靶酶拓扑异构酶IV。

5 药物的排外特性

细菌细胞膜上有外排泵， 当人提服用药物后，会有选择地将药物排出细胞外，因此细菌不至于被高浓度药物杀死，确保细菌存活，这也是形成耐药性的一大重要原因[11]。 而在相关研究中也发现，细胞的排外系统具有不同类型，例如根据能量形式和结构可以进行区分；另外也可以通过电化学质子梯度来外排药物运转系统。

在分析肠球菌时可发现， 该病菌具有外排系统，无论何种菌株，其主动排外现象均存在，这与药物的低敏感度有很大关联，其中也有研究证明，肠球菌敏感株对诺氟沙星等药物具有主动外排能力[12]。

6 肠球菌的多重耐药外排泵EmeA

细菌易化族类物质会介导病菌对喹诺酮类抗菌药产生耐药性，通常EmeA 蛋白会引起耐药的不仅仅单纯指喹诺酮类药物，还包含多种结构上与之相似的无关药物[13]。 在临床中，通过将基因缺失菌株和基因互补株对诺氟沙星的MIC 值进行比较， 发现对诺氟沙的敏感性相较于野生株高两倍。 丁月平等[14]人也研究了EmeA 的外排泵外排活性，通过将粪肠球菌的一条片段克隆到大肠艾希氏菌，经过测量显示，这一片段还有两个开放读码框， 其中之一便是emeA 基因，再将其克隆到大肠艾希氏菌上，发现耐药性提高了四倍以上[15]。

7 肠球菌耐药性预防

肠球菌和革兰阳性菌不同，它对多种抗菌药物具有固有或获得耐药机制，所以实际的耐药情况十分复杂，例如对于青霉素等药物的耐药机制是由低亲和力青霉素结合蛋白过量产生而使得细胞膜渗透力下降所致；反观对于喹诺酮类抗菌药，则由螺旋酶和拓扑异构酶IV 位点的改变，致使诺耐药性产生[16]。 而有研究也表明，屎肠球菌和粪肠球菌对青霉素、环丙沙星的耐药敏感率均高于70%，不过肠球菌对于氨基糖苷类抗生素表现出天然低水平耐药，所以在临床中也有学者提议，需要检测肠球菌对于高浓度青大霉素以及链霉素等药物的敏感性，以此来推测耐药性；当然为了降低耐药性，临床中也主张联合用药[17]。 但是近年来，随着耐药肠球菌的感染者逐渐增多，且缺乏较为可靠的治疗药物，在未进一步做出深入研究前，临床医师仍然要严格控制抗生素使用，避免其引起医院感染爆发。

综上所述，目前在临床中，肠球菌对于喹诺酮抗菌药的耐药性日渐提升，所以深入研究耐药机制十分重要。 而据当前的研究发现，耐药机制要么局限于靶酶突变，要么局限于药物的主动排外。 在今后的研究中，应当将耐药性、靶酶突变以及药物主动排外相联合，根据结构与功能间的关系，研究药物与酶之间的相互作用。 在研究的同时也需要对喹诺酮类药物进行深度开发，使之疗效更加确切，同时成为同时作用于DNA 促旋酶和拓扑异构酶IV 的新型喹诺酮类抗菌药。