细胞焦亡相关分子在急性胰腺炎模型小鼠胰腺中的表达

赵梦琦 崔梦妍 江巧丽 陆颖影

急性胰腺炎（AP）是临床常见急腹症，是一种可由轻度自限性病程发展为重度的合并多器官功能衰竭的系统性疾病[1]。AP的发病机制较复杂，目前普遍认为其与炎性反应、氧化应激、微循环障碍、肠道菌群移位等相关。随着研究的不断深入，近年来发现的一种细胞程序性死亡模式——细胞焦亡，与细胞凋亡及细胞坏死一同被认为对AP的发生及预后有重要影响。细胞焦亡是一种由天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）介导的具有促炎和溶解作用的细胞死亡模式，其有特殊的形态学和作用机制，主要表现为细胞质膜破裂，细胞内促炎物质释放，此外还存在核凝聚、染色体DNA断裂和降解等现象[2]。本研究主要观察以3种方式制备的AP模型小鼠的细胞焦亡相关因子的表达，探讨细胞焦亡在AP发生和发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备和分组

选取20只SPF级雄性C57BL/6小鼠（购自上海雷根生物科技有限公司），体质量为20～25 g，采用随机数表法分为对照组、雨蛙肽组（CAE组）、CAE＋ 脂 多 糖（LPS） 组 和 L-精 氨 酸（L-Arg）组，每组5只，后3组分别制备AP模型。L-Arg组 给 予 腹 腔 注 射 8% L-Arg（4 g/kg，pH＝7.0）2次，2次中间间隔1 h，注射完成后72 h麻醉小鼠取血，处死小鼠取胰腺组织；CAE组给予腹腔注射雨蛙肽（50 µg/kg，1次/h），注射10次后间隔1 h麻醉小鼠取血，处死小鼠取胰腺组织；CAE＋LPS组给予腹腔注射雨蛙肽（50 µg/kg，1次/h），注射10次后，间隔1 h再注射1次LPS（5 mg/kg），间隔1 h麻醉小鼠取血，处死小鼠取胰腺组织；对照组给予腹腔注射PBS（50 µg/kg，1次 /h），注射 10次后，间隔1 h 麻醉小鼠取血，处死小鼠取胰腺组织。分离血浆，置于-80 ℃冰箱保存；取胰腺组织，一部分立即放入冻存管后置于液氮中保存，其余以4%多聚甲醛固定备用。

1.2 胰腺组织病理学检查

胰腺组织以4%多聚甲醛溶液固定，经脱水、石蜡包埋、切片后行H-E染色，在光学显微镜下观察组织病理学变化。胰腺组织病理学评分参考Schmidt标准[3]，从水肿、出血、坏死、炎性细胞浸润4个方面进行评分。

1.3 血清学指标检测

3个AP模型组和对照组小鼠麻醉后均于眼球取血，分离血清，采用1500-056型全自动生物化学分析仪（德国Thermo公司）检测血清淀粉酶和脂肪酶，采用ELISA法检测血清炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-18）水平（试剂盒购自上海联科生物科技有限公司），按照说明书操作。

1.4 实时荧光定量PCR法检测细胞焦亡相关分子的mRNA表达水平

应用TRIzol试剂（购自上海新贝生物科技有限公司）提取胰腺组织总RNA，采用实时荧光定量PCR法检测Caspase-1、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、Gasdermin D（GSDMD）、IL-1β的mRNA表达水平（RT试剂盒和SYBGreen荧光定量PCR试剂盒均购自上海新贝生物科技有限公司）。引物由上海新贝生物科技有限公司设计并合成，以Rplpo为内参，引物序列见表1。根据公式2-△△Ct计算目的基因mRNA的相对表达量。

表1 引物序列

1.5 蛋白质印迹法检测相关蛋白表达水平

应用RIPA裂解液（碧云天生物技术有限公司）提取胰腺组织总蛋白，应用BCA试剂盒（碧云天生物技术有限公司）测定蛋白浓度。采用蛋白质印迹法检测胰腺组织中NLRP3、Caspase-1前体（Pro-Caspase-1）、活化的 Caspase-1（Cleaved-Caspase-1）、IL-1β前体（Pro-IL-1β）、IL-1β蛋白表达水平，以GAPDH为内参，最后用ECL化学发光试剂（美国Thermo公司）进行显影。兔抗小鼠NLRP3、Cleaved-caspase1、Pro-IL-1β、IL-1β抗体（美国CST公司）和兔抗小鼠Pro-Caspase-1抗体（英国Abcam公司）的工作浓度均为1∶1 000；羊抗兔IgG-HRP二抗（美国CST公司）的工作浓度为1∶5 000。应用Amersham Imager 600全自动化学发光成像分析系统（美国GE公司）扫描，以目的条带与内参条带的灰度值比值表示蛋白表达水平。

1.6 免疫荧光染色法检测胰腺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β的蛋白表达水平

采用免疫荧光染色法检测胰腺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β的蛋白表达水平。胰腺组织石蜡切片经烤片、脱蜡、水化、抗原修复后，PBS冲洗5 min×3次；置于湿盒，始终保持湿润，组织化学笔封闭后滴加封闭剂，室温下封闭1 h；PBS冲洗5 min×3次，分别孵育NLRP3、Caspase-1和IL-1β一抗（1∶100）后4 ℃过夜。次日早晨室温下复温30 min后，PBS冲洗5 min×3次，孵育相对应的荧光二抗（1∶200），避光放置1 h；PBS冲洗5 min×3次，滴加DAPI，避光孵育＜8 min，再次PBS冲洗5 min×3次，滴加防荧光淬灭剂，封片，每张切片随机选取10个不重叠的视野图像，荧光显微镜下拍照观察。

1.7 统计学分析

应用GraphPadPrism 7.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（）表示，2组符合正态分布的数据间比较采用t检验，3组及以上的比较采用单因素方差分析，不符合正态分布的数据采用Kruskal-Wallis检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组的胰腺组织病理学变化

对照组胰腺组织病理无明显变化，CAE组、CAE＋LPS组和L-Arg组小鼠的胰腺组织均出现不同程度的水肿（叶内、小叶内、腺泡间、细胞间隔增大）、出血、坏死和炎性细胞浸润等病理改变，4组的病理评分分别为0.6±0.1、3.4±0.4、10.1±0.8和9.3±0.8，3组AP模型小鼠的胰腺组织病理评分均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P均＜0.05），胰腺组织病理改变以CAE＋LPS组和L-Arg组较为严重。见图1。

图1 4组小鼠的胰腺组织病理图像 H-E染色 ×200 A 对照组 B CAE组 C CAE＋LPS组 D L-Arg组

2.2 各组的血清淀粉酶、脂肪酶水平比较

对 照 组、CAE组、CAE＋LPS组 和L-Arg组的血清淀粉酶水平分别为（574.6±67.3）U/L、（1 388.0±264.5）U/L、（1 196.0±142.4）U/L 和（1 755.0±233.4）U/L；血清脂肪酶水平分别为（253.0±29.5）U/L、（775.7±14.2）U/L、（586.8±26.5）U/L和（629.9±15.6）U/L。与对照组相比，3组AP模型小鼠的血清淀粉酶、脂肪酶水平均显著升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见图2。

图2 4组小鼠的血清淀粉酶和脂肪酶水平比较 A 血清淀粉酶 B 血清脂肪酶

2.3 各组的血清中炎性因子水平比较

ELISA法检测结果显示，对照组、CAE组、CAE＋LPS组、L-Arg组的血清TNF-α水平分别为（24.7±4.5）pg/mL、（29.3±6.0）pg/mL、（96.0±16.5）pg/mL和（103.8±31.2）pg/mL；血 清 IL-1β水平分别为（1.5±0.4）pg/mL、（3.0±0.4）pg/mL、（18.5±2.4）pg/mL和（3.9±0.4）pg/mL；血清IL-18水平分别为（88.9±4.7）pg/mL、（178.7±37.2）pg/mL、（173.7±33.8）pg/mL 和（250.0±67.0）pg/mL。3组AP模型小鼠的血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平均较对照组升高，除CAE组的血清TNF-α和IL-18水平与对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）外，各组间其余指标的差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见图3。

图3 4组小鼠的血清中炎性因子水平比较 A TNF- B IL-1 C IL-18

2.4 各组的胰腺组织中细胞焦亡相关分子的mRNA表达水平比较

3组AP模型小鼠的胰腺组织中细胞焦亡相关分 子ASC、Caspase-1、GSDMD及IL-1β的 mRNA表达水平均较对照组升高，除CAE组ASC和GSDMD的mRNA表达水平与对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）外，各组间其余指标的差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见图4。

图4 4组小鼠的胰腺组织中细胞焦亡相关分子的mRNA表达水平 A ASC mRNA B Caspase-1 mRNA C GSDMD mRNA D IL-1β mRNA

2.5 各组的胰腺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β的蛋白表达水平比较

蛋白质印迹法检测结果显示，对照组胰腺组织 中 NLRP3、Cleaved-Caspase-1、IL-1β蛋 白 呈 低表达， Pro-Caspase-1和Pro-IL-1β蛋白呈高表达。3组AP模型小鼠的胰腺组织中NLRP3、Cleaved-Caspase-1、IL-1β蛋白表达水平较对照组升高，除L-Arg组与对照组的NLRP3表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余差异均有统计学意义（P均＜0.05)；而3组AP模型小鼠的胰腺组织中Pro-Caspase-1和Pro-IL-1β表达水平则较对照组降低，其中Pro-Caspase-1与对照组的差异均有统计学意义（P均＜0.05)。这说明AP造模后前体蛋白转为活性状态，AP时胰腺腺泡细胞发生焦亡。见图5。

图5 4组小鼠的胰腺组织中NLRP3、Pro-Caspase1、Cleaved-Caspase-1、Pro-IL-1 、IL-1 的蛋白表达水平比较 A 蛋白电泳图 B 柱形图

免疫荧光染色结果显示，NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白在胰腺腺泡细胞胞质中表达，且与对照组相比，3组AP模型小鼠胰腺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β的蛋白表达水平均明显升高。与CAE组相比，CAE＋LPS组和L-Arg组的NLRP3、IL-1β蛋白表达水平明显升高，而3组AP模型小鼠胰腺组织中Caspase-1蛋白的表达水平相似。见图6。

图6 4组小鼠胰腺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1 的蛋白表达水平比较 免疫荧光染色法 ×200 A Caspase-1蛋白 B IL-1 蛋白 C NLRP3蛋白

3 讨论

AP是一种复杂的胰腺炎性反应，大多数患者病情为轻度且具有自限性，但根据2012年修订版AP亚特兰大分类标准，约有30%的AP患者被归为中度AP，约有10%患者被归为重度AP[4]，重度AP患者多伴有多器官损伤。胰腺腺泡细胞死亡方式及途径一直是研究的热点。近年来细胞焦亡已在免疫性疾病、感染性疾病、动脉粥样硬化、恶性肿瘤等多种疾病的研究中被报道，其在疾病中发挥的作用也越来越受到重视。细胞焦亡的特征是将Pro-Caspase-1激活为Cleaved-Caspase-1，后者可切割GSDMD形成具有打孔功能的N端，使细胞完整性丧失后发生渗透性溶解而导致细胞死亡，其也可切割Pro-IL-1β、Pro-IL-18形成成熟的促炎因子IL-1β和IL-18并促进其释放[5]，进而募集炎性细胞，加重炎性反应。

细胞焦亡相关分子包括炎性小体、效应分子、“杀手蛋白”GSDMD等，其中炎性小体是一类大分子蛋白复合体，主要包括NLRP3、NLRP1、NLRC4、NLRP6、AIM2、pyrin等，其中被研究得较多的是NLRP3。有研究报道，抑制NLRP3激活，可通过抑制炎性反应减轻AP症状，NLRP3活性增强也是诱导急性肺损伤（ALI）的原因之一[6-7]。这些研究结果均表明抑制NLRP3活性对于AP及其诱导的ALI具有治疗潜力。炎性Caspase可特异性作用于GSDMD蛋白，即使被不同类型的Caspase作用，也都可导致细胞焦亡，是介导细胞焦亡过程的关键蛋白[2,8]。有研究表明，下调GSDMD蛋白的表达可抑制与炎性反应相关的细胞焦亡[9]。细胞焦亡过程中的效应分子包括IL-1β、IL-18和高迁移率组蛋白1（HMGB1）等，它们是诱导细胞因子和趋化因子释放、促进炎症级联反应的关键环节，与AP病情严重程度密切相关[10]。HMGB1可导致多器官损伤，是在AP病程中介导肠道细菌移位的重要因素之一[11]。根据既往研究结果推测，HMGB1可能通过抑制NF- B通路和NLRP3激活，阻遏肠道细胞焦亡进程，进而抑制肠道炎性反应，维持肠道稳态，从而减轻胰腺的炎性反应[12-13]，但胰腺与肠道细胞焦亡之间的关系有待进一步探讨。

本研究结果显示，与对照组相比，以3种方式制备的AP模型小鼠的胰腺组织病理损伤明显，血清淀粉酶、脂肪酶及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-18水平升高，胰腺组织中细胞焦亡相关分子（Caspase-1、ASC、GSDMD 和 IL-1β） 的 表 达水平升高，提示在AP小鼠中存在细胞焦亡，且可加重炎性反应。本文探究了以不同造模方式制备的AP小鼠胰腺中细胞发生焦亡的情况，但仅观察了AP中Caspase-1介导的需炎性小体参与的经典途径的细胞焦亡相关分子表达情况，而未对Caspase-4/5/11介导的不需炎性小体参与的非经典途径进行研究，并且尚未探索在AP进程中哪种胰腺的细胞发生焦亡而发挥了作用。目前研究已经发现细胞焦亡的发生、发展对于AP病情严重程度及预后具有重要意义，但细胞焦亡在AP病程中的具体作用机制还有待深入研究，其在AP治疗及预后方面的应用潜力也需进一步探索。