移植沉默miR-214的骨髓间充质干细胞对大鼠肝纤维化的影响

吴振兴 夏青青

肝纤维化是一种可逆性损伤，是各种慢性肝病发展为肝硬化的必经阶段，也是原发性肝癌的一种前期预兆[1]。骨髓间充质干细胞（BMSC）在不同诱因下可在体内外分化为神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞和肝样细胞。动物实验结果表明，BMSC移植在肝纤维化治疗中具有一定效果，但其机制尚未明确[2]。Yang等[3]的研究指出，BMSC经miR-214抑制物转染后，其细胞培养上清可提高同种异体BMSC在急性肝衰竭大鼠中的治疗潜力，这提示miR-214可能在一定程度上影响BMSC的治疗效果。本研究通过构建CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型，研究移植沉默miR-214的BMSC对其的治疗作用，并探讨相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞株

选取50只9月龄的SPF级雄性SD大鼠，体质量为390～410 g，均购自上海睿太莫斯生物科技有限公司。大鼠第3代BMSC细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 BMSC鉴定

选取第3代BMSC，在DMi8-M倒置荧光显微镜（购自德国Leica公司）下观察细胞形态。经0.25%胰蛋白酶消化、离心后，制成细胞密度为1×106个/mL的单细胞悬液。取100 µL单细胞悬液，加入无菌EP管，根据流式多因子检测试剂盒操作要求加入抗大鼠CD29、CD34、CD44、CD45单克隆抗体（各2 µL，均购自美国Gibco公司），充分振荡，4 ℃孵育20 min，使用流式细胞仪鉴定BMSC表面特异性标志物。

1.3 BMSC转染

选取第3代BMSC，经0.25%胰蛋白酶消化、离心后，置于含10%胎牛血清的DMEM培养基内重悬细胞，调整细胞密度为1×105个/mL，重新接种至6孔板，待细胞再次融合至70%时，参照LipofactamineTM3000试剂盒（购自上海吉玛制药技术有限公司）说明书进行细胞转染。构建miR-214沉默RNA重组真核载体pcDNA3.1-miR-214 inhibitor和阴性对照载体pcDNA3.1-NC，并转染至BMSC，分别设为沉默组、阴性对照组，另取不作处理的BMSC设为空白对照组。3组均设5个复孔，37 ℃、5% CO2培养6 h后更换为含10%胎牛血清的DMEM完全培养基，继续培养至48 h。

1.4 BMSC中miR-214表达水平的检测

采用实时荧光定量PCR法检测各组BMSC中miR-214的相对表达量。取沉默组、阴性对照组、空白对照组细胞，经PBS洗涤，采用TRIzal法提取细胞总RNA，测定总RNA的浓度和纯度后，使用反转录试剂盒得到对应的cRNA。使用StepOneTMPuls荧光定量PCR仪（购自美国ABI公司），反应条件为：95 ℃预变性6 min；95 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共计40个循环。以U6作为内参，采用2-△△Ct法分析miR-214的相对表达量。实验所用引物见表1。

表1 引物序列

1.5 构建肝纤维化大鼠模型

50只大鼠饲养1周后，在大鼠背部皮下注射体积分数为30%的CCl4花生油溶液（剂量为3 mL/kg），每周注射2次，连续8周，每周称重后调节注射剂量。注射8周后将50只大鼠随机分为PBS组（12只）、BMSC组（12只）、miR-214 NC组（13只）和miR-214 inhibitor组（13只），处死后观察大鼠肝纤维化情况，实验结束剔除建模失败及移植BMSC后死亡大鼠的数据。最终各组均纳入10只大鼠。

1.6 干预方式

选取第3代BMSC，在注射前48 h，掺入BrdU并使其终浓度为10 µmol/L。PBS组经门静脉注射0.5 mL PBS，BMSC组经门静脉注射0.5 mL含有2×106个BMSC的PBS，miR-214 NC组经门静脉注射0.5 mL含有2×106个转染pcDNA3.1-NC的BMSC的PBS，miR-214 inhibitor组经门静脉注射0.5 mL含 有2×106个 转 染pcDNA3.1-miR-214 inhibitor的BMSC的PBS。使用无菌棉签压迫止血5 min，均为一次性注射。

1.7 组织取材

移植3周后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，取腹主动脉血5 mL，离心后冷冻保存；血液采集完毕后，采用颈椎脱臼法处死大鼠，迅速解剖，分离肝脏，切取4 mm左右厚度的肝组织，使用4%多聚甲醛固定，用于免疫组织化学染色及Masson染色，其余组织迅速保存于液氮中待测。

1.8 大鼠肝功能指标检测

取1.7小节中冷冻保存的血清，使用Mindray BS-180全自动生物化学分析仪（购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）检测ALT和AST的表达水平，严格按照ALT、AST检测试剂盒（均购自上海瑞番生物科技有限公司）说明书操作。

1.9 BMSC定植情况检测

采用免疫组织化学染色法检测BMSC的定植情况。取经4%多聚甲醛固定48 h的肝脏组织，用冷冻切片机切片（厚度约10 µm），灭活内源性过氧化物酶后经HCl处理使DNA变性；脱除HCl，加入硼酸缓冲液在室温条件下中和反应10 min，PBS充分冲洗，5% BSA封闭液封闭20 min，滴加鼠抗BrdU多克隆抗体（1∶100），4 ℃过夜，PBS充分冲洗，滴加山羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min，PBS充分冲洗，DAB显色试剂盒显色15 min，苏木精复染，经二甲苯透明后封片。荧光显微镜下观察细胞，细胞核呈棕黄色为阳性细胞。

1.10 BMSC分化情况检测

采用免疫组织化学双重染色法检测BMSC的分化情况。肝脏组织切片后滴加鼠抗BrdU多克隆抗体（1∶100），4 ℃过夜，PBS充分冲洗，一抗为兔抗大鼠BrdU抗体、山羊抗兔Alb抗体，二抗为山羊抗兔FITC标记抗体及兔抗羊RITC标记抗体。按照说明书设计检测步骤，荧光显微镜下观察，在同一视野用2种荧光拍照后叠加图片观察BrdU、Alb共表达情况。

1.11 肝星状细胞凋亡情况检测

采用TUNEL和 -SMA免疫组织化学双重染色法检测肝星状细胞的凋亡情况。肝组织切片后，灭活内源性过氧化物酶，经HCl处理使DNA变性，蛋白酶K消化10 min；加入标记缓冲液与标记液，37 ℃标记2 h；加入生物素标记抗地高辛抗体，37 ℃反应30 min；加入SABC，37 ℃反应60 min；NBT/BCIP显色20～60 min，血清封闭， -SMA染色，脱水，透明后封片，显微镜下观察并计数。

1.12 各组肝纤维化程度检测

采用Masson染色法观察各组的肝纤维化程度。取1.7小节中的肝组织，经石蜡包埋、切片、常规脱蜡，苏木精染液染色10 min，蒸馏水漂洗；1%盐酸分化液分化5 s，蒸馏水冲洗；Masson染色液染色10 min，蒸馏水漂洗；0.2%冰醋酸溶液浸洗2 min，1%磷钼酸溶液浸洗4 min；苯胺蓝染色液复染；置于0.2%冰醋酸溶液；无水乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片后，经光学显微镜观察肝纤维化程度。根据《肝纤维化诊断及治疗共识（2019年）》判断肝纤维化分期[4]：0期指无纤维化；Ⅰ期指汇管区扩大，局限窦周与小叶纤维化；Ⅱ期指汇管区纤维化，形成少量纤维间隔；Ⅲ期指形成大量纤维间隔，小叶结构紊乱；Ⅳ期指早期肝硬化。

1.13 肝组织中TGF-β1、p38 MAPK和p-p38 MAPK的蛋白表达水平检测

采用蛋白质印迹法检测肝组织中转化生长因子- 1（TGF- 1）、p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷酸化-p38 MAPK（p-p38 MAPK）蛋白的表达水平。取100 mg保存于液氮的肝组织，加入RIPA裂解液，研磨后匀浆，移至离心管，置于冰上，离心取上清液，采用BCA法测定蛋白含量。取50 µg蛋白样本按1∶5比例与上样缓冲液混合，置于沸水5 min，离心取上清液，经TY-80型电泳仪（购自南京普阳科学仪器研究所）电泳后湿转至硝酸纤维素膜，脱脂牛奶封闭2 h，加入兔抗大鼠TGF- 1、p38 MAPK、p-p38 MAPK一抗（1∶500，购自美国Abcam公司），4 ℃摇床孵育过夜，加入山羊抗兔IgG二抗（1∶2 000，购自美国Abcam公司），室温摇床孵育2 h，TBST洗涤3次，置于暗室内显影，使用Gene GENIUS凝胶成像系统（购自英国Syngene公司）扫描后，分析灰度值，计算TGF- 1、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的相对表达量及p-p38 MAPK/p38 MAPK比值。

1.14 统计学处理

应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（）表示，2组间比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSC的形态观察及表面特异性标志物鉴定

经倒置显微镜观察，结果显示第3代BMSC呈梭形、圆形或多角形，排列紧密，部分成团，折光性强；传代后细胞生长与扩增能力旺盛，传代过程中细胞贴壁生长，至第7天融合度＞80%，呈长梭形。流式细胞仪检测结果显示，BMSC表面CD29和CD44的表达率均＞95%，而CD34和CD45为阴性表达。

2.2 BMSC中miR-214的表达水平

转染后，沉默组的miR-214相对表达量为0.41±0.02，低于空白对照组（1.12±0.08）和阴性对照组（1.07±0.07），差异均有统计学意义（P均＜0.05）。空白对照组与阴性对照组的miR-214相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 各组肝功能指标比较

与PBS组比较，BMSC组血清ALT、AST的表达水平较低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；与BMSC组和miR-214-NC组比较，miR-214 inhibitor组血清ALT、AST的表达水平较低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。BMSC组与miR-214 NC组血清ALT、AST的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组血清ALT、AST的表达水平比较

2.4 肝组织中BMSC的定植情况

在荧光显微镜下观察肝组织切片，结果显示在BMSC组、miR-214 inhibitor组和miR-214 NC组中均可见BrdU标记的阳性细胞，该细胞呈圆形，灶状分布，细胞核呈棕黄色，这提示局部移植的BMSC可在肝组织定植。

2.5 肝组织中BMSC的分化情况

在荧光显微镜下观察肝组织切片，结果显示BrdU标记的阳性细胞呈灶状分布，Alb标记的阳性细胞呈片状弥漫性分布。将BrdU及Alb标记的图片叠加后可观察到部分共表达BrdU和Alb细胞，其中部分细胞呈圆形，与肝细胞形状相似，这提示局部移植的BMSC可分化为有功能的肝细胞。

2.6 各组肝星状细胞凋亡率比较

BMSC组肝星状细胞的凋亡率为（1.73±0.57）%，高于PBS组 [（1.24±0.35）%]，差异有统计学意义（P＜0.05）。miR-214 inhibitor组肝星状细胞的凋亡率为（2.59±0.57）%，高于BMSC组和 miR-214 NC组 [（1.75±0.62）%]，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。BMSC组与miR-214 NC组肝星状细胞的凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.7 各组肝纤维化程度比较

Masson染色结果显示，PBS组细胞排列紊乱，细胞间隙存在明显脂肪变性，出现胶原纤维组织增生，肝小叶异常增生形成假小叶；BMSC组和miR-214 NC组细胞排列紊乱情况有所改善，细胞间隙存在少量脂肪变性，纤维组织增生及假小叶形成均有所减少；miR-214 inhibitor组细胞排列紊乱情况进一步改善，未发现脂肪填充，有少量纤维组织增生及假小叶形成。见表3、图1。

表3 各组肝纤维化程度比较/例

图1 各组肝纤维化病理图 Masson染色 ×200 A PBS组 B BMSC组 C miR-214 NC组 D miR-214 inhibitor组

2.8 各组肝组织中TGF-β1蛋白表达水平及p-p38 MAPK/p38 MAPK比值比较

与PBS组比较，BMSC组肝组织中TGF- 1蛋白的表达水平及p38 MAPK/p-p38 MAPK比值较低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与BMSC组和miR-214 NC组比较，miR-214 inhibitor组肝组织中TGF- 1蛋白的表达水平及p38 MAPK/p-p38 MAPK比值较低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。BMSC组与miR-214 NC组肝组织中TGF- 1蛋白的表达水平及p38 MAPK/p-p38 MAPK比值的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4、图2。

图2 蛋白质印迹法检测各组肝组织中TGF- 1、p38 MAPK、p-p38 MAPK和p38 MAPK蛋白的表达水平

表4 各组肝组织中TGF- 1蛋白的相对表达量及p38 MAPK/p-p38 MAPK比值比较

3 讨论

肝纤维化是由多种病因及慢性刺激导致的肝内结缔组织异常增生[5]。目前认为其发病机制主要是肝脏中细胞外基质合成与分解失衡，致其大量沉积于肝脏，形成纤维化[6]。寻找有效的药物和治疗手段遏制并逆转肝纤维化过程，对于临床治疗慢性肝病及预防肝硬化具有重要意义。BMSC是成体多功能干细胞，拥有多向分化和自我更新的能力，在修复组织损伤中发挥重要作用，可抑制肝星状细胞激活并诱导其凋亡，分解胶原纤维，分泌损伤修复因子，促进肝细胞再生，从而抑制肝纤维化[7-8]。

miRNA是一类内源性非编码短序列RNA，具有调控基因的作用[9]。近年来研究发现，miRNA在BMSC增殖、分化、迁移及细胞因子旁分泌等病理、生理过程中起关键作用，并参与调控BMSC组织损伤修复过程[10]。Wang等[11]在研究BMSC对1型糖尿病成骨分化的作用时发现，miR-214-3p激动剂AgomiR-214-3p可抑制BMSC的成骨分化，而miR-214-3p抑制剂AntagomiR-214-3p则可增强BMSC的成骨分化作用，推测miR-214可作为BMSC成骨分化的关键调节剂。本研究结果显示，与BMSC组和miR-214 NC组比较，miR-214 inhibitor组血清ALT、AST表达水平较低，且Masson染色结果显示miR-214 inhibitor组肝细胞排列紊乱情况得到改善，纤维组织增生及假小叶形成减少，这提示移植沉默miR-214的BMSC可保护肝纤维化大鼠的肝功能，并减轻肝纤维化程度。由此推测，沉默miR-214可增强BMSC分化为肝细胞的能力，从而抑制肝纤维化的进展。

TGF- 1是一种多功能的生长因子[12]。在肝纤维化过程中，TGF- 1通过调控TGF- 1/p38 MAPK信号通路刺激肝星状细胞活化，使p38 MAPK磷酸化，抑制蛋白水解酶合成，导致细胞外基质累积，胶原蛋白合成增加，促进肝星状细胞增殖和迁移，加重肝纤维化程度[13-14]。Ghafoory等[15]关于小鼠肝损伤的研究表明，TGF- 1缺乏可减轻小鼠肝纤维化程度。另有研究表明，抑制TGF- 1/Smads信号通路可有效防止肝细胞发生上皮-间质转化，阻滞肝纤维化进展[16]。本研究结果显示，与BMSC组和miR-214 NC组比较，miR-214 inhibitor组肝组织中TGF- 1蛋白的表达水平及p38 MAPK/p-p38 MAPK比值较低，这提示移植沉默miR-214的BMSC对大鼠肝纤维化的抑制作用可能与调控TGF- 1/p38 MAPK信号通路有关。

综上所述，移植沉默miR-214的BMSC可抑制大鼠肝纤维化，这可能与调控TGF- 1/p38 MAPK信号通路有关。本研究仅检测了TGF- 1、p-p38 MAPK和p38 MAPK的蛋白表达水平，未能完全阐明移植沉默miR-214的 BMSC后对肝纤维化的具体作用机制，在今后的研究中需进一步探索。