炎症性肠病患者肠黏膜组织中miR-129与PDCD4表达的关系及意义

杨永强 李 娟 钟海川 符芳辉

炎症性肠病（IBD）是一种以慢性炎性反应为特征的肠道疾病，包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），其症状主要包括直肠出血、腹痛、腹泻和疲劳，病情具有反复性，难以治愈[1]。IBD的病因目前尚未完全明确，可能与遗传因素、免疫系统受损、环境诱导、肠道共生菌群变化等有关[2]。研究显示，西方国家的IBD发病率已趋于稳定，但发展中国家的IBD发病率呈逐年升高趋势，目前IBD已成为消化医学领域的研究热点[3]。因此，探究与IBD发病相关的分子机制具有重要意义。

多种miRNA在IBD的病理过程中发挥着关键作用[4-6]。杨文宏等[6]的研究显示，miR-125b和miR-335在IBD患者的肠黏膜组织及血清中表达下调，其在血清中的表达水平与患者的疾病严重程度及活动度密切相关。研究表明，miR-129不仅在多种肿瘤（骨肉瘤、鼻咽癌、结肠癌和肺癌等）的发病中发挥了作用，而且在癫痫、糖尿病、椎间盘退行性变、心力衰竭和肥胖症等非恶性肿瘤疾病中也起着作用，并有潜力作为糖尿病、癫痫等疾病的生物标志物[7]。程序性细胞死亡因子4（PDCD4）是一种抑癌基因，能够调节细胞凋亡、蛋白质翻译、炎性反应及信号转导，而IL-12、IL-2和IL-15等可调控PDCD4的表达水平[8]。Kim等[9]的研究表明，PDCD4在结直肠癌中低表达，其表达水平与肿瘤分化程度及患者5年生存率有关，可以作为结直肠癌的预后预测指标。目前关于IBD患者中miR-129和PDCD4表达水平的报道较少。本研究检测了IBD患者肠黏膜组织中miR-129和PDCD4的表达水平，并分析了两者的相关性，以及其与患者疾病活动度的关系，以期为临床诊断IBD提供帮助。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2017年7月至2020年1月于海南省万宁市人民医院消化内科就诊的176例活动期IBD患者设为IBD组，其中94例为UC患者（设为UC组），82例为CD患者（设为CD组）。IBD组患者中，男性97例，女性79例，年龄28～59岁，平均年龄为（40.30±7.87）岁。另选择同期在该院就诊的100例结肠息肉患者设为对照组，其中男性58例，女性42例，年龄30～58岁，平均年龄为（40.68±7.82）岁。IBD组与对照组的性别、年龄差异均无统计学意义（P均＞0.05），具有可比性。CD组患者中，男性45例，女性37例，平均年龄为（39.46±7.54）岁，根据CD活动指数（CDAI）将CD组患者分为轻度CD组（28例）、中度CD组（31例）和重度CD组（23例）。UC组患者中，男性52例，女性42例，平均年龄为（41.04±8.16）岁，根据改良Mayo评分将UC组患者分为轻度UC组（30例）、中度UC组（32例）和重度UC组（32例）[10]。本研究经医院医学伦理委员会批准（批件号170519），所有入组者均签署了知情同意书。

1.2 纳入标准与排除标准

纳入标准：（1）活动期IBD患者均符合相关诊断标准[10]，并结合活体组织病理检查、结肠镜检查结果确诊；（2）处于疾病活动期；（3）无精神疾病史。排除标准：（1）合并凝血功能障碍；（2）肠道穿孔者；（3）3个月内使用过免疫抑制剂、糖皮质激素等；（4）合并肠结核等感染性疾病；（5）患有类风湿关节炎等自身免疫病；（6）合并恶性肿瘤。

1.3 肠黏膜组织中miR-129和PDCD4表达水平检测

采用实时荧光定量PCR法检测各组患者肠黏膜组织的miR-129和PDCD4表达水平。在IBD组患者入院行肠镜检查时取肠黏膜病变组织，在对照组患者行肠镜下息肉切除术时取距息肉＞5 cm的回肠或结肠活体组织，活体组织均置于-80 ℃环境保存待测。取-80 ℃保存的肠黏膜组织，在低温环境中研磨成粉末，然后使用RNA提取试剂盒[购自天根生化科技（北京）有限公司，货号DP419]从中抽提得到总RNA。使用微量蛋白分析仪检测RNA质量，吸取1 μg RNA，使用反转录试剂盒（购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号R212-01）进行反转录，然后使用SYBR Green染料[购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，货号QPS-201]配制成10 μL反应体系，在实时荧光定量PCR仪[购自乐普（北京）医疗器械股份有限公司，型号Lepgen-96]上采集信号，扩增条件为：95 ℃ 60 s预变性；之后95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共40个循环。miR-129以U6作为内参，PDCD4以GAPDH作为内参，采用 2-∆∆Ct法计算 miR-129和 PDCD4的相对表达量。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 统计学方法

应用SPSS 23.0软件对数据进行统计学分析。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，2组间比较采用t检验，3组间比较采用单因素方差分析。采用Pearson相关系数法分析IBD患者肠黏膜组织中miR-129与PDCD4表达水平的相关性，以及miR-129和PDCD4的表达水平分别与改良Mayo评分、CDAI评分的相关性。采用ROC曲线评估肠黏膜组织中miR-129和PDCD4表达水平诊断IBD的效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IBD组与对照组的miR-129和PDCD4表达水平比较

IBD组患者肠黏膜组织中miR-129、PDCD4的相对表达量分别为0.82±0.23、0.67±0.19，均低于对照组（1.36±0.35、1.02±0.27），2组的差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

2.2 UC组与CD组的miR-129和PDCD4表达水平比较

如表2所示，UC组与CD组的miR-129和PDCD4表达水平差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

表2 UC组与CD组的miR-129和PDCD4表达水平比较

2.3 不同疾病活动度患者的miR-129和PDCD4表达水平比较

94例UC患者中，轻度UC组、中度UC组、重度UC组的miR-129和PDCD4表达水平依次降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。82例CD患者中，轻度CD组的miR-129和PDCD4表达水平均高于中度CD组和重度CD组，而中度CD组的miR-129和PDCD4表达水平均高于重度CD组，组间差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见表3。

表3 不同疾病活动度患者的miR-129和PDCD4表达水平比较

2.4 IBD患者肠黏膜组织中miR-129与PDCD4表达水平的相关性分析

相关性分析结果显示，IBD患者肠黏膜组织中miR-129与PDCD4的表达水平呈正相关（r＝0.735，P＝0.000）。见图1。

图1 IBD患者肠黏膜组织中miR-129与PDCD4表达水平的相关性分析

2.5 miR-129和PDCD4表达水平与疾病活动度的相关性分析

相关性分析结果显示，UC组的miR-129和PDCD4表达水平均与改良Mayo评分呈负相关（r＝-0.580、r＝-0.595，P均＝0.000），见图2。CD组的miR-129和PDCD4表达水平均与CDAI评分呈负相关（r＝-0.508、r＝-0.498，P均＝0.000）。见图3。

图2 UC组的miR-129和PDCD4表达水平与改良Mayo评分的相关性分析 A miR-129与改良Mayo评分 B PDCD4与改良Mayo评分

图3 CD组的miR-129和PDCD4表达水平与CDAI评分的相关性分析 A miR-129与CDAI评分 B PDCD4与CDAI评分

2.6 miR-129和PDCD4表达水平诊断IBD的ROC曲线分析

ROC曲线分析结果显示，IBD组患者肠黏膜组织中miR-129表达水平诊断IBD的ROC曲线下 面 积（AUC）为 0.759（95%CI：0.703～0.816），最佳截断值为1.26，敏感度为71.60%，特异度为72.00%；PDCD4表达水平诊断IBD的AUC为0.867（95%CI：0.821～0.913），最佳截断值为 0.87，敏感度为85.80%，特异度为76.00%；miR-129联合PDCD4诊断IBD的AUC、敏感度、特异度分别为0.911（95%CI：0.874～0.947）、83.50% 和 85.00%。见图4。

图4 miR-129和PDCD4诊断IBD的ROC曲线

3 讨论

IBD是一种消化系统常见疾病，包括UC和CD，UC病变主要累及结直肠，患者常出现腹泻、便血；而CD常见病变部位是回肠末端，可导致腹痛、体质量减轻和排便习惯改变[11]。目前，IBD的发病机制尚未完全明确，既往研究报道IBD的发生受到环境因素、免疫系统缺陷、遗传易感性及个体肠道微生物群改变的共同影响[12]。研究表明，IBD的持续时间、病变范围和病情严重程度，炎性假性息肉的存在，原发性硬化性胆管炎及结直肠癌家族史是IBD相关结直肠癌的主要危险因素[13]。近年来，亚洲的IBD发病率不断升高，严重影响了患者的生活质量[14]。因此，深入探究IBD的发病机制对于寻找临床治疗靶点至关重要。

miRNA参与调节人体免疫、炎性反应等生理功能，其在IBD患者中的异常表达参与了NF-κB介导的炎性反应和肠黏膜屏障功能的损伤及修复[4]。部分miRNA可作为IBD的血清学诊断标志物，并可用于鉴别CD与UC[5]。既往研究表明，miR-129-5p在多种炎性疾病中作为炎性反应和细胞凋亡的新型调节剂。Wan等[15]的研究结果显示，miR-129-5p在脊髓损伤小鼠模型中表达下调，通过抑制高迁移率族蛋白B1（HMGB1）/Toll样受体4（TLR4）/NF-κB信号通路来抑制炎性反应，从而促进机体损伤修复。Meng等[16]的研究表明，与健康人相比，CD或UC患者的miR-129表达水平显著降低，通过负向调节泛素连接酶FBW7的表达水平抑制NF-κB信号通路，从而改善IBD症状。本研究中IBD组miR-129的表达水平显著低于对照组，与上述研究结果相符，这提示miR-129可能参与了IBD的发生、发展过程。本研究结果还显示，UC组与CD组患者的miR-129表达水平差异无统计学意义，这提示miR-129不能用于鉴别诊断UC与CD。miR-129的表达水平分别在轻度、中度、重度UC和CD患者组中依次降低，这提示miR-129的表达水平与疾病严重程度有关，且miR-129表达水平降低可能促进了IBD的进展。

PDCD4作为肿瘤抑制因子，可抑制肿瘤细胞的生长，并可促进肿瘤细胞凋亡[8]。研究表明，PDCD4缺失可导致急性结肠炎小鼠血清中IL-6表达上调，以及肠组织中IL-6、TNF-α表达水平升高，从而加重病情，促进急性结肠炎相关结肠癌的进展[17]。本研究结果显示，IBD组肠黏膜组织中PDCD4表达水平显著低于对照组，UC组与CD组的PDCD4表达水平差异无统计学意义，这提示PDCD4可能参与调控IBD的病理过程，但不能用于临床鉴别UC与CD。王刚等[18]的研究显示，随着由呼吸道合胞病毒引发的毛细支气管炎病情的加重，血清PDCD4表达水平下降。本研究结果显示，在CD和UC患者中，轻度组的PDCD4表达水平均高于中度组，而中度组的PDCD4表达水平均高于重度组，这提示PDCD4的表达水平随着疾病活动度增高而降低，PDCD4可能参与了IBD的发生和发展。

研究显示，PDCD4在脑血管疾病机体中的异常表达受到miRNA的调控[19]。本研究结果显示，IBD组肠黏膜组织中miR-129与PDCD4的表达水平呈正相关，这提示miR-129、PDCD4可能共同参与了IBD的病理过程。此外，本研究结果还显示，UC组的miR-129、PDCD4表达水平与改良Mayo评分呈负相关，CD组的miR-129、PDCD4表达水平与CDAI评分呈负相关，这提示miR-129、PDCD4的表达水平与UC及CD患者的疾病活动度密切相关。ROC曲线分析结果显示，miR-129、PDCD4单项及两项联合诊断IBD的AUC分别为0.759、0.867和0.911，这提示两项联合诊断的效能更高，可用于IBD的辅助诊断。

综上所述，IBD患者肠黏膜组织中miR-129和PDCD4的表达水平下调，且miR-129和PDCD4的表达水平与UC及CD患者的疾病活动度有关，其有望成为早期诊断IBD的生物标志物。本研究的不足之处在于纳入的病例数有限，且未对miR-129及PDCD4调控IBD的具体机制进行深入分析。今后课题组将扩大样本量，进一步探讨相关作用途径。