肝性脑病患者外周血Th17/Treg平衡变化及其与预后的关系

杨君寅 计钰亮 朱婷婷

肝性脑病（HE）是由于肝炎相关肝硬化引起机体神经系统调节紊乱，从而导致的神经失调综合征[1-2]。有研究报道，全球每年有50～120万人死于肝硬化及其并发症，其中并发HE的患者有30%～45%，其3年生存率低于25%，严重影响人们的生命安全[3-4]。既往研究表明，HE的发病机制主要是氨基酸比例失衡、血氨升高等，近年来有学者指出免疫功能和炎性反应在HE的发生、发展过程中起着重要作用[5-6]。Th17细胞和Treg细胞属于CD4＋T细胞亚群，其介导的炎性反应和免疫应答在多种肝脏疾病的进展中发挥了重要作用[7-8]。目前机体内Th17/Treg平衡变化在HE进展过程中的作用尚未明确。本文探究了HE患者外周血Th17/Treg平衡变化及其与预后的关系，以期为HE的临床诊治提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年2月至2020年2月中国人民武装警察部队海警总队医院收治的50例HE患者作为研究对象，参照West-Haven分级标准将患者分为HE 0～Ⅱ级组（n＝25）和HE Ⅲ～Ⅳ级组（n＝25）；另选择同期在该院就诊的25例慢性肝病患者（设为慢性肝病组），以及在该院体检的25名健康者（设为健康对照组）纳入研究。HE 0～Ⅱ级组中，男13例，女12例；年龄39～78岁，平均年龄为（56.96±8.75）岁。HE Ⅲ～Ⅳ级组中，男15例，女10例；年龄38～76岁，平均年龄为（56.47±8.69）岁。慢性肝病组中，男11例，女14例；年龄40～79岁，平均年龄为（57.10±8.81）岁。健康对照组中，男12例，女13例；年龄37～79岁，平均年龄为（56.81±8.72）岁。4组的上述基本资料相比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准（批件号 202021）。

1.2 纳入标准及排除标准

纳入标准：（1）符合《中国肝性脑病诊治共识意见（2013年，重庆）》[9]中的诊断标准；（2）经彩超或CT检查确诊为肝硬化合并HE；（3）慢性肝病组患者的病程均超过6个月且无肝硬化及HE；（4）健康对照组的体检结果均显示无心、肺、肾等重要脏器疾病，无慢性肝病史；（5）签署知情同意书。排除标准：（1）合并肝癌或其他恶性肿瘤；（2）严重的心、肺、肾等重要脏器功能障碍；（3）中毒性脑病或代谢性脑病；（4）脑血管疾病、颅脑损伤或感染；（5）癫痫、精神分裂症等所致精神行为异常，无法配合检查、治疗；（6）合并自身免疫病或严重过敏性疾病。

1.3 方法

（1）外周血Th17/Treg比值测定。所有受试者在入院或体检时采集3 mL空腹静脉血，经肝素抗凝后，采用Ficoll密度梯度离心法提取外周血单个核细胞（PBMC），然后采用流式细胞术检测PBMC中Th17细胞、CD4＋CD25＋Treg细胞表达水平；取300 μL抗凝血加入等体积RPMI-1640培养基中，并接种于培养板，同时加入20 μL佛波酯（1 μg/mL）＋18 μL 离 子 霉 素（40 μg/mL）＋20 μL莫 能 霉 素（0.1 mg/mL），在培养箱中孵育6 h；取100 μL上述培养液，加入10 μL抗人CD4和CD25单克隆抗体，震荡混匀，室温避光条件下孵育20 min，加入100 μL细胞固定液；再次于室温避光条件下孵育20 min，以1 500 r/min的转速离心5 min，弃上清液，加入100 μL破膜液，并加入10 μL抗IL-17单克隆抗体和10 μL抗Foxp3抗体，使用流式细胞仪（购自北京友华照钦医疗器械有限公司，型号DxFLEX）检测全血中Th17细胞、Treg细胞占比，并计算Th17/Treg比值。（2）血清IL-17、IL-10、转化生长因子-β（TGF-β）表达水平检测。所有受试者在入院或体检时采集3 mL空腹静脉血，以3 000 r/min的转速离心5 min，分离得到血清，采用ELISA法检测IL-17、IL-10和TGF-β的表达水平，严格按照试剂盒说明书操作（试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司）。（3）血清ALT、AST和血氨水平检测。采用恩普A8020型全自动生物化学分析仪（购自上海聚慕医疗科技有限公司）检测血清ALT、AST和血氨水平。（4）一般资料收集。收集受试者的性别、年龄、BMI、肝功能分级、HE分级、药物使用情况（乳果糖、拉克替醇、利福昔明-α晶型、门冬氨酸鸟氨酸和益生菌）等信息。肝功能分级采用Child-Pugh分级评估，内容包括一般状况、血清胆红素、腹水、血清白蛋白和凝血酶原时间，总分5～6分为A级，7～9分为B级，10～15分为C级。（5）HE的治疗方案。给予HE患者去除诱因、降低血氨水平、护肝等治疗方案，治疗时间为1周。（6）预后评估标准。HE患者治疗1周后若精神意识恢复，神经症状减轻或消失，生命体征平稳，判断为预后良好；若精神意识不清，神经症状未见好转，生命体征不稳定，甚至死亡，判断为预后不良。

1.4 统计学方法

应用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。采用多因素logistic回归法分析预后的影响因素，采用ROC曲线评估外周血Th17/Treg比值判断HE患者预后的效能。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组外周血Th17/Treg比值及炎性因子水平比较

HE Ⅲ～Ⅳ级组、HE 0～Ⅱ级组和慢性肝病组的Th17/Treg比值、IL-17表达水平均高于健康对照组，HE Ⅲ～Ⅳ级组和HE 0～Ⅱ级组的Th17/Treg比值、IL-17表达水平均高于慢性肝病组，HE Ⅲ～Ⅳ级组的Th17/Treg比值、IL-17表达水平均高于HE 0～Ⅱ级组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。HE Ⅲ～Ⅳ级组、HE 0～Ⅱ级组和慢性肝病组的IL-10、TGF-β表达水平均低于健康对照组，HE Ⅲ～Ⅳ级组和HE 0～Ⅱ级组的IL-10、TGF-β表达水平均低于慢性肝病组，HE Ⅲ～Ⅳ级组的IL-10、TGF-β表达水平均低于HE 0～Ⅱ级组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见表1。

表1 4组的外周血Th17/Treg比值及炎性因子水平比较

2.2 预后良好组与预后不良组的一般资料及外周血Th17/Treg比值的比较

50例HE患者治疗1周后有14例预后不良，36例预后良好。预后不良组与预后良好组患者的性别、年龄、BMI、药物使用情况的差异均无统计学意义（P均＞0.05）。与预后良好组比较，预后不良组中肝功能Child-Pugh C级占比、HE Ⅲ～Ⅳ级占比、Th17/Treg比值，以及ALT、AST、血氨、IL-17的表达水平均较高，而IL-10、TGF-β的表达水平均较低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见表2。

表2 预后良好组与预后不良组的一般资料及外周血Th17/Treg比值的比较

2.3 影响HE患者预后的相关因素分析

将可能与HE患者预后有关的因素（纳入标准P＜0.05），包括肝功能分级、HE分级、ALT、AST、血氨、Th17/Treg比值、IL-17、IL-10、TGF-β作为自变量，将患者预后情况作为因变量（赋值情况见表3），纳入多因素logistic回归分析，结果显示肝功能分级、HE分级、AST、血氨、Th17/Treg比值、IL-17为HE患者预后不良的危险因素，而TGF-β为预后不良的保护因素（P＜0.05）。见表4。

表3 变量与赋值

表4 影响HE患者预后的多因素logistic回归分析

2.4 外周血Th17/Treg比值与患者预后的关系

ROC曲线分析结果显示，外周血Th17/Treg比值判断患者预后的最佳截断值为1.76，敏感度为92.86%，特异度为91.67%，AUC为0.958，95%CI为0.860～0.995。见图1。

图1 外周血Th17/Treg比值判断HE患者预后的ROC曲线

3 讨论

HE是由严重肝病引起的、以代谢紊乱为基础的中枢神经失调综合征，临床表现为智力减退、行为失常，预后较差且病死率较高，其发病机制尚未完全阐明[10]。近年来有学者指出，免疫失衡和炎性反应会促进神经毒物的产生，并提高脑组织对毒物的敏感度，从而影响大脑功能，导致HE的发生和发展[11-12]。

Th17细胞和Treg细胞是近年来发现的不同于Th1、Th2细胞的CD4＋T细胞亚群，其在病毒性肝炎、肝硬化等肝脏疾病患者的免疫系统中发挥着重要的调节作用[13]。本研究结果显示，相较于慢性肝病患者和健康体检者，HE患者的外周血Th17/Treg比值、IL-17水平升高，IL-10、TGF-β水平降低，且随着HE病情加重，Th17/Treg比值、IL-17水平呈逐渐升高趋势，IL-10、TGF-β水平呈逐渐降低趋势。Th17细胞是由Th0细胞在IL-6和TGF-β共同作用下分化形成的，可分泌促炎因子IL-17，而IL-17能促进T细胞激活，并刺激内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞生成多种趋化因子，参与中性粒细胞的增殖、活化和成熟，介导炎性反应[14-15]。Treg细胞可抑制自身抗原或外来抗原引起的免疫反应，可通过分泌IL-10、TGF-β等细胞因子或直接通过细胞接触发挥免疫调控作用，减轻炎性反应，缓解由于炎性因子表达水平过高引发的全身性病理损伤，在机体免疫耐受与自身稳态维持中发挥着重要作用[16]。研究表明，随着HE患者病情加重，炎性反应逐渐增强，而免疫调控作用减弱，导致患者外周血Th17/Treg比值显著升高，且HE分级越高其比值也越高[17]。这与本研究的结果相符。

本研究中50例HE患者在治疗1周后有14例预后不良，36例预后良好。结果显示，与预后良好组比较，预后不良组的Th17/Treg比值，以及ALT、AST、血氨、IL-17的表达水平均较高，而IL-10、TGF-β的表达水平均较低。多因素logistic回归分析结果显示，AST、血氨、Th17/Treg比值、IL-17为影响HE患者预后的危险因素，而TGF-β为影响预后的保护因素，这提示炎性因子与免疫功能是影响患者预后的重要因素。分析其原因为，HE患者体内炎性介质大量蓄积，通过血脑屏障后可抑制脑组织的正常生理活动，并可影响中枢神经系统功能，进一步影响HE的进展和预后[18]；Treg细胞数量增多及功能修复可以有效减少肝细胞坏死，但随着HE预后变差，肝损伤持续加重，会导致机体T细胞总数减少及功能减弱，从而导致免疫失衡，这是影响预后的重要因素[19-20]。本研究采用ROC曲线分析外周血Th17/Treg比值对患者预后的预测价值，结果显示AUC为0.958，敏感度为92.86%，特异度为91.67%，这提示外周血Th17/Treg比值可作为评估HE病情严重程度、预后的重要指标。

综上所述，HE患者外周血Th17/Treg比值显著升高，其判断患者预后的效能较高，可为探究HE的病情进展及临床诊治提供新思路。本研究存在一定的不足之处，如样本量较小、预后评估标准较为主观等，可能造成结果偏倚，今后课题组将进一步扩大样本量，并尽量选取客观的预后评估指标，以验证本研究的结论。