miR-132靶向调控PTEN基因对雨蛙素诱导的急性胰腺炎模型胰腺腺泡细胞增殖及凋亡的影响

王 伟 朱婷婷 刘家豪

急性胰腺炎（AP）是以胰腺局部炎性反应为主要特征的疾病，其发病率和病死率均较高。研究表明，胰腺腺泡细胞凋亡是AP发生和发展的关键因素[1-2]，因此，探寻AP的新型生物治疗靶标以有效抑制胰腺腺泡细胞凋亡已成为临床研究热点。磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN）基因是一种抑癌基因，能够通过拮抗磷酸化酶的活性影响肿瘤细胞的增殖和代谢。研究表明，PTEN在AP模型大鼠的胰腺组织中呈高表达，且通过激活Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路抑制AP细胞的生长[3]。赵明一等[4]的研究表明，抑制PTEN表达可显著促进AP患者胰腺腺泡细胞增殖并抑制细胞凋亡。miRNA是一种内源性非编码小分子RNA，能够参与细胞增殖、凋亡等生理学过程[5]。既往动物实验研究结果显示，miR-132在胰腺炎模型大鼠的胆汁中表达上调[6]。Zhao等[7]的研究结果显示，miR-132可靶向下调PTEN表达，从而阻断阿尔茨海默病模型中β-淀粉样蛋白诱导的神经毒性作用。目前关于miR-132和PTEN在AP患者胰腺腺泡细胞中的生物学行为的报道较少。本研究探讨了miR-132和PTEN对雨蛙素诱导的AP模型胰腺腺泡细胞增殖及凋亡的影响，并分析两者的关系，以期为提高AP的临床治疗效果提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及AP模型构建

大鼠胰腺腺泡细胞系MZ-M0321细胞株购自宁波明舟生物科技有限公司。MZ-M0321细胞经解冻、复苏后，置于含10%灭活胎牛血清＋青霉素-链霉素混合液的RPMI-1640培养液（购自上海吉至生化科技有限公司）中，在37 ℃、5% CO2的培养箱（购自日本Sanyo公司）中培养，每2日换液1次（无菌操作），进行传代培养。

AP细胞模型的构建：造模前1 d取MZ-M0321细胞接种于6孔板（1.2×106个/孔），培养24 h后加入100 nmol/L雨蛙素[纯度≥98%，规格1 mg，购自翌圣生物科技（上海）有限公司]刺激6 h，继续培养12 h，收集上清液，采用ELISA法检测IL-6、TNF-α的表达水平，试剂盒均购自无锡云萃生物科技有限公司，每组设置6个复孔[8]。

1.2 细胞转染及分组

取1.1小节中未经雨蛙素处理的MZ-M0321细胞设为空白对照组，经雨蛙素处理的MZ-M0321细胞设为雨蛙素组。采用慢病毒转染法进行转染，转染前1日取经雨蛙素处理的细胞接种于6孔板（1.2×106个/孔），培养24 h后，更换为不含胎牛血清的培养液，随机分为3组：（1）无义序列组采用转染试剂（LipofectamineTM3000，购自上海吉至生化科技有限公司）将miR-132-mimics-NC序列（由百奥迈科生物技术有限公司设计、合成）转染至MZ-M0321细胞；（2）miR-132过表达组 采用转染试剂将miR-132-mimics序列（由百奥迈科生物技术有限公司设计、合成）转染至MZ-M0321细胞；（3）共转染组 参照转染试剂盒说明书操作，先将脂质体与质粒载体pcDNA-PTEN（由上海吉玛制药技术有限公司设计、合成）以8 μL∶4 μg的比例在250 μL Opti-MEMTM培养基中稀释混匀，加入含有miR-132-mimics序列的培养液中，转染至MZM0321细胞。3组细胞转染后继续培养48 h。每组设置6个复孔，重复测量3次。

1.3 miR-132和PTEN mRNA表达水平检测

采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中miR-132、PTENmRNA的表达水平。提取1.2小节中各组MZ-M0321细胞中的总RNA并检测浓度，以RNA为模板进行反转录，所得cDNA进行PCR反应。配置20 μL反应体系，包含2×UltraSYBR Mixture 10.0 μL、cDNA 模板（25 ng/μL）2.0 μL、上下游引物各2.0 μL和ddH2O 4.0 μL。反应条件：预变性 95 ℃ 30 s；之后 95 ℃ 5 s变性，60 ℃ 30 s退火，72 ℃ 20 s延伸，共40个循环。miR-132以U6作为内参，PTEN以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-132和PTENmRNA的相对表达量。引物均由宝生物工程（大连）有限公司设计并合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 细胞增殖情况检测

采用MTT法检测各组细胞的增殖情况。取1.2小节中各组MZ-M0321细胞，经胰酶消化后接种至24孔板（2.5×104个/孔），加入MTT试剂（购自上海吉至生化科技有限公司，20 μL/孔，5 mg/mL），培养2 h后弃上清，加入150 μL DMSO并振荡，使用酶标仪（购自美国Thermo公司）检测490 nm处各孔细胞的光密度（OD）值。细胞增殖抑制率＝（对照组OD值－实验组OD值）/对照组OD值×100%。每组重复测量3次。

1.5 细胞凋亡情况检测

采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。取1.2小节中各组MZ-M0321细胞，按照AnnexinVFITC/PI细胞凋亡双染试剂盒（购自上海复申生物科技有限公司）说明书操作，取100 μL细胞悬液（1×106个 /mL），加 入 5 μL AnnexinV-FITC＋10 μL PI（20 μg/mL），混匀，避光孵育30 min，使用流式细胞仪（购自常州必达科生物科技有限公司）检测细胞凋亡率。每组重复测量3次。

1.6 细胞PTEN、增殖和凋亡相关蛋白表达水平检测

采用蛋白质印迹法检测各组细胞中PTEN、增殖和凋亡相关蛋白（Bcl-2、Ki-67和Bax）的表达水平。取1.2小节中各组MZ-M0321细胞，使用RIPA裂解液裂解3 min，离心取上清液，行电泳、转模、5%脱脂牛奶封闭3 h，加入兔抗鼠一抗（PTEN、Ki-67、Bcl-2和Bax）及内参GAPDH（均购自北京索莱宝科技有限公司），按照1∶1 000的比例稀释，过夜；次日加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗（购自北京索莱宝科技有限公司，1∶5 000），室温孵育2 h，显色、显影、定影，测定PTEN、Bcl-2、Ki-67和Bax蛋白的相对表达量。

1.7 双荧光素酶报告基因实验

TargetScan数据库显示PTEN与miR-132核苷酸存在结合位点，采用PCR技术扩增PTEN-3'UTR序列中包含与miR-132存在结合位点的片段，插入至荧光素酶pGL3载体中，构建PTEN野生型质粒（PTEN-WT），并利用基因突变技术将个别结合位点序列突变，构建突变型质粒（PTEN-MT）。使用转染试剂将PTEN-WT、PTEN-MT分别与mimics-NC、miR-132-mimics转染至MZ-M0321细胞，设为mimics-NC-PTEN-WT组、miR-132-mimics-PTENWT组、mimics-NC-PTEN-MT组和miR-132-mimics-PTEN-MT组，转染48 h后，用PBS洗涤细胞，加入250 μL RIPA裂解液于室温摇床中摇晃15 min，之后加入50 mL荧光素酶检测试剂Ⅱ，使用自动荧光素酶检测仪测定荧光强度A，再加入Stop＆Glo试剂，测定荧光强度B，以A/B表示荧光素酶的相对活性。

1.8 统计学方法

应用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AP模型的造模情况

雨蛙素组细胞的TNF-α、IL-6表达水平分别为（323.58±48.50）ng/L、（356.79±53.52）ng/L，均高于空白对照组[（118.96±17.83）ng/L、（98.77±14.80）ng/L]，组间比较差异均有统计学意义（t＝9.700，P＝0.000；t＝11.382，P＝0.000）。这提示 AP模型构建成功。

2.2 各转染组细胞的miR-132、PTEN mRNA表达水平比较

如表2所示，与无义序列组比较，miR-132过表达组的miR-132表达水平较高，PTENmRNA表达水平较低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；与miR-132过表达组比较，共转染组的PTENmRNA表达水平较高，差异有统计学意义（P＜0.05），但2组的miR-132表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。这提示细胞转染成功。

表2 各转染组细胞的miR-132、PTEN mRNA水平比较

2.3 各转染组细胞增殖情况比较

miR-132过表达组的细胞增殖抑制率为（-28.87±4.33）%，低于无义序列组（0），差异有统计学意义（P＜0.05）；共转染组的细胞增殖抑制率为（-16.73±2.51）%，高于miR-132过表达组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 各转染组细胞凋亡情况比较

无义序列组、miR-132过表达组和共转染组的细胞凋亡率分别为（38.03±5.71）%、（12.01±1.81）%和（22.77±3.42）%。与无义序列组比较，miR-132过表达组的细胞凋亡率降低，差异有统计学意义（t＝10.640，P＝0.000）；与miR-132过表达组比较，共转染组的细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（t＝6.811，P＝0.000）。见图1。

图1 流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率 A 无义序列组 B miR-132过表达组 C 共转染组

2.5 各转染组中PTEN、增殖和凋亡相关蛋白表达水平比较

与无义序列组比较，miR-132过表达组的Ki-67、Bcl-2蛋白表达水平升高，PTEN、Bax蛋白表达水平降低，2组比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）；与miR-132过表达组比较，共转染组的Ki-67、Bcl-2蛋白表达水平降低，PTEN、Bax蛋白表达水平升高，2组比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见表3、图2。

图2 蛋白质印迹法检测各转染组中PTEN、Bax、Ki-67和Bcl-2蛋白的表达水平

表3 各转染组中PTEN、增殖和凋亡相关蛋白表达水平比较

2.6 双荧光素酶报告基因实验检测miR-132对PTEN的转录调控

TargetScan数据库显示miR-132与PTEN基因序列存在结合位点，见图3。mimics-NC-PTENWT组、miR-132-mimics-PTEN-WT组、mimics-NCPTEN-MT组和miR-132-mimics-PTEN-MT组的荧光素酶相对活性分别为1.37±0.20、1.00±0.18、0.98±0.19和1.02±0.16，其中miR-132-mimics-PTEN-WT组的荧光素酶活性显著低于mimics-NC-PTEN-WT组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 miR-132与PTEN的靶向关系

3 讨论

AP是一种可累及其他脏器的常见急性炎性疾病，具有发病迅速、进展快、并发症多、病死率高的特点[9]。研究表明，TNF-α可促进促炎因子IL-6的合成及释放，从而引发全身炎症反应综合征及多器官功能障碍综合征，其在AP发病时表达水平升高[10-11]。本研究结果显示，雨蛙素组细胞的TNF-α、IL-6表达水平均显著高于空白对照组，这提示AP细胞模型构建成功。

miRNA能够调控靶基因的表达，参与细胞增殖、凋亡等生理学过程[12]。刘芬等[13]的研究表明，miR-132过表达可显著抑制脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞炎性反应。Kumstel等[6]的研究结果显示，在胰腺炎模型大鼠血清中miR-132的表达下调，并参与了炎性反应。另有研究表明，胰腺腺泡细胞增殖及凋亡失衡是导致AP发生、发展的机制之一[14]。Ki-67是一项评价细胞增殖状态的指标，Bcl-2是人体重要的抑制凋亡基因，而Bax是促进凋亡基因[15]。本研究结果显示，在成功转染MZ-M0321细胞后，与无义序列组比较，miR-132过表达组的细胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表达水平均显著降低，而Ki-67、Bcl-2蛋白表达水平均升高。这提示miR-132表达上调可能促进了雨蛙素诱导的AP MZM0321细胞增殖并抑制该细胞凋亡。

PTEN是同源10号染色体丢失的磷酸酶基因，参与了多种病理、生理状态下的炎性反应[16]。Kong等[17]的研究结果显示，沉默PTEN基因表达可抑制AP模型胰腺腺泡细胞凋亡，并促进细胞增殖。本研究结果显示，与无义序列组比较，miR-132过表达组的PTENmRNA及蛋白水平均降低；而在细胞转染miR-132-mimics序列并上调PTEN表达后，miR-132过表达所致的促进细胞增殖及抑制细胞凋亡的能力均在一定程度上减弱，这提示miR-132过表达可能通过靶向下调PTEN表达而促进雨蛙素诱导的AP MZ-M0321细胞增殖并抑制该细胞凋亡。既往研究表明，miR-132表达上调可通过下调PTEN表达而抑制慢性阻塞性肺疾病的进展[18]，与本文结论相符。本研究从生物信息学预测网站得知miR-132与PTEN基因存在结合位点，且双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-132-mimics-PTEN-WT组的荧光素酶活性显著弱于mimics-NC-PTEN-WT组。以上结果提示miR-132表达上调可促进雨蛙素诱导的AP MZ-M0321细胞增殖并抑制该细胞凋亡，这可能是通过靶向下调PTEN表达实现的。

综上所述，上调miR-132表达可能通过靶向下调PTEN表达，从而促进雨蛙素诱导的AP MZM0321细胞增殖并抑制该细胞凋亡。本研究为探寻AP的新型生物治疗靶标以改进AP的治疗方案提供了参考依据。