miR-23a-3p、miR-376c-3p在结直肠癌患者血清中的表达水平及与预后的关系

丁银蓉 刘 扬 黄秀芹 叶星照 姚明亚 汪 莉

结直肠癌是中国常见的消化道恶性肿瘤之一，确诊时的疾病分期是决定患者预后的主要因素之一[1]。早期结直肠癌的5年生存率高于70%，若发生远处转移，则5年生存率为10%～20%[2]。随着中国居民医疗条件的改善，人们的健康体检意识也逐渐提高，早期结直肠癌的检出率有所升高，但检出率及生存率依然显著低于日韩等国[3]。结肠镜是目前筛查、诊断结直肠癌的最佳手段，但其属于有创性检查，难以在体检人群中广泛开展[4]；目前已发现的肿瘤标志物的特异度较低，难以单独作为恶性肿瘤的诊断依据[5]。因此，临床中迫切需要寻找敏感度及特异度更高的诊断和预后判断的指标。近年来，多种循环微RNA(miRNA)被发现可作为恶性肿瘤的潜在生物标志物，具有高稳定性、易于获取及可重复采样的特点，有望成为理想的生物标志物[6]。miR-23a-3p、miR-376c-3p分别属于miR-23家族和miR-376家族，多项研究发现，miR-23a在结直肠癌中表达升高[7-8]，但关于其亚型miR-23a-3p的相关报道较少；目前有关miR-376c-3p与结直肠癌关系的研究仅局限于结直肠癌细胞株，提示miR-376c-3p的表达下调可能与结肠癌细胞的恶性侵袭表型相关[9]，两者在结直肠癌患者外周血循环中的表达水平以及对结直肠癌诊断方面的作用仍有待进一步探讨。本研究探讨了结直肠癌患者血清miR-23a-3p、miR-376c-3p表达的临床意义及其与患者预后的关系，以期为临床应用提供参考依据。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选择2012年1月至2019年1月温州医科大学附属第一医院收治的结直肠癌患者作为研究对象。纳入标准：(1)患者均符合《中国结直肠癌诊疗规范(2017年版)》[10]中的诊断标准；(2)均行根治性手术治疗；(3)首次诊断并治疗；(4)术前未行放射、化学治疗等抗肿瘤治疗；(5)病历资料及随访资料完整。排除标准：(1)结直肠癌复发；(2)合并其他急慢性感染性疾病；(2)合并全身其他系统的恶性肿瘤。共有78例结直肠癌患者被纳入研究，收集患者的病历资料及手术相关记录，包括肿瘤直径、分化程度、T分期、淋巴结转移、静脉侵犯、腹膜播散、肝转移、Duke′s分期等。同时，选择同期在本院体检的60位健康志愿者作为健康对照组。78例患者中，男性54例，女性24例，年龄为41～75岁，平均年龄为(62.8±10.4)岁；健康对照组中，男性41例，女性19例，年龄为43～78岁，平均年龄为(60.7±12.5)岁。两组受试者在性别、年龄方面的差异无统计学意义，具有可比性。所有受试者对本研究知情同意，并签署知情同意书。

1.2 外周血miR-23a-3p、miR-376c-3p表达水平检测

患者入院后，抽取肘静脉血5 mL，3 000 r/min离心5 min，分离血浆后低温冻存；健康志愿者在体检时采用同样方法获取血液标本。参照总RNA快速抽提试剂盒[购自艾康生物技术(杭州)有限公司]说明书提取总RNA，检测RNA浓度与纯度。应用RNA反转录试剂盒(购自日本Takara公司)将RNA反转录合成cDNA，采用RT-PCR检测miR-23a-3p、miR-376c-3p的相对表达量。PCR中miR-23a-3p、miR-376c-3p的引物序列见表1，引物均购自武汉博士德生物工程有限公司。qPCR反应体积为20 μL，反应条件为95 ℃预变性3 min；之后95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，总计40个循环，设置3个重复孔。以U6作为内参基因，计算Ct值，采用2-△△Ct法检测外周血miR-23a-3p、miR-376c-3p的相对表达量。

表1 引物序列

1.3 随访

采用门诊形式进行定期随访。术后第1年，每3个月门诊随访1次，之后每6个月随访1次，直至随访终点或研究结束。总体生存期(OS)定义为从随机化开始至因任何原因死亡的时间。无病生存期(DFS)定义为从随机化开始至疾病复发或因任何原因死亡的时间。随访截止时间为2020年1月31日。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 血清miR-23a-3p、miR-376c-3p的表达水平

RT-PCR检测结果显示，健康对照组和结直肠癌组中miR-23a-3p的相对表达量分别为1.35±0.51、2.62±0.89，miR-376c-3p的相对表达量分别为3.56±0.78、1.22±0.35，两组相比较差异均具有统计学意义(P均<0.05)。Spearman等级相关检验发现，在结直肠癌患者中，miR-23a-3p与miR-376c-3p的表达水平无明显相关关系(r=0.101 2，P=0.374 7)。见图1。

图1 两组中miR-23a-3p、miR-376c-3p的表达水平比较 A 两组血清miR-23a-3p的相对表达量 B 两组血清miR-376c-3p的相对表达量 C 结直肠癌组中血清miR-23a-3p与miR-376c-3p表达的相关性

2.2 miR-23a-3p、miR-376c-3p的表达水平对患者临床病理参数的影响

结直肠癌组患者血清miR-23a-3p、miR-376c-3p的中位表达水平分别为2.25、1.14，高于中位表达水平定义为高表达组，低于或等于中位表达水平定义为低表达组。单因素分析显示，miR-23a-3p高表达对患者的静脉侵犯、肝转移、Duke′s分期有明显消极影响(P<0.05)，即Duke′s分期越高、存在静脉侵犯或肝转移，患者血清miR-23a-3p的表达水平就越高。miR-376c-3p低表达对患者的肿瘤分化程度、静脉侵犯、Duke′s分期有明显消极影响(P<0.05)，即Duke′s分期越高、肿瘤分化程度越低、存在静脉侵犯，患者血清miR-376c-3p表达水平就越低。具体见表2。

表2 miR-23a-3p、miR-376c-3p的表达水平对患者临床病理参数的影响/例(%)

2.3 miR-23a-3p表达水平与患者生存率的关系

Log-rank生存分析显示，miR-23a-3p高表达组患者的OS(χ2=4.55，P=0.032)、DFS(χ2=7.231，P=0.007)均显著低于miR-23a-3p低表达组，表明miR-23a-3p的表达水平对结直肠癌患者的生存有显著影响，miR-23a-3p表达水平越高，患者预后越差。见图2。

图2 miR-23a-3p表达水平与患者生存率的关系 A 与OS的关系 B 与DFS的关系

2.4 miR-376c-3p表达水平与患者生存率的影响

Log-rank生存分析显示，miR-376c-3p低表达组患者的OS(χ2=4.798，P=0.028)、DFS(χ2=3.597，P=0.042)均显著低于miR-376c-3p高表达组，表明miR-376c-3p的表达水平对结直肠癌患者的生存有显著影响，miR-376c-3p表达水平越低，患者预后越差。见图3。

图3 miR-376c-3p表达水平与患者生存率的关系 A 与OS的关系 B 与DFS的关系

2.5 影响结直肠癌患者OS、DFS的Cox回归分析

Cox回归分析结果显示，肿瘤T分期、Duke′s分期、miR-23a-3p表达水平、miR-376c-3p表达水平是影响患者OS的独立危险因素(P<0.05)；Duke′s分期、miR-23a-3p表达水平、miR-376c-3p表达水平是影响患者DFS的独立危险因素(P<0.05)。见表3、表4。

表3 影响结直肠癌患者OS的Cox回归分析

表4 影响结直肠癌患者DFS的Cox回归分析

3 讨论

早期结肠癌缺乏特异性症状，导致许多患者错过了最佳手术时机。美国癌症协会的现行指南强调了非侵入性诊断工具的重要性，如粪便免疫化学检测、高敏感度粪便潜血检测和CT扫描等[11]，而目前中国的结肠癌筛查仍然高度依赖于对危险人群行结肠镜检查。由于结肠镜检查属于侵入性检查，许多无症状的高危人群存在明显的排斥心理，因此迫切需要找到一种新的无创性的诊断方法。循环miRNA检测已被认为是多种肿瘤的有效的无创筛查方法，关于循环miRNA在结肠癌中表达意义的相关研究目前也已展开。miR-23a-3p在多种肿瘤中存在异常表达，Qin等[12]利用GSE61741芯片数据发现，血清miR-23a-3p是结肠癌诊断的可靠标志物，与miR-663a联合诊断时AUC大于0.800，提示以此为基础构建评分系统区分肿瘤患者与一般人群是可靠和稳定的。miR-376c-3p是近年来新发现的一种miRNA，在多种肿瘤细胞实验中均表现出抑瘤效应，但目前关于miR-376c-3p在结肠癌患者血清或组织中表达的报道较少。因此，本研究通过检测患者血浆中miR-23a-3p、miR-376c-3p的表达水平，以期为结肠癌的无创诊断提供新思路和新方法。

本研究结果发现，在结直肠癌患者中miR-23a-3p的相对表达量明显升高，miR-376c-3p的相对表达量显著下调，表明两者在结直肠癌患者外周血中表达水平均存在明显异常，但表达趋势相反，这可能意味着miR-23a-3p、miR-376c-3p对恶性肿瘤的发生、发展起着相反的作用，即miR-23a-3p发挥促癌基因的效应，而miR-376c-3p可能具有抑癌基因作用。本研究进一步发现，miR-23a-3p高表达对患者的静脉侵犯、肝转移、Duke′s分期有明显不良影响，而miR-376c-3p低表达对患者的肿瘤分化程度、静脉侵犯、Duke′s分期有明显不良影响。提示miR-23a-3p高表达、miR-376c-3p低表达可导致结直肠癌患者病理参数的恶化。

肿瘤临床试验中常用OS评价药物的疗效[13]，当患者的预期生存时间较长时，它通常是首选终点。OS突出的优点在于记录方便，无论是院内还是院外，较容易确定患者的死亡日期。DFS常用于根治性手术或放射治疗后的辅助治疗研究，目前为结肠癌辅助治疗的主要审批基础。本研究同时记录了患者的OS及DFS，结果发现miR-23a-3p高表达组患者的OS、DFS显著低于低表达组，而miR-376c-3p低表达组患者的OS、DFS显著低于高表达组，这与临床病理参数分析的趋势一致。周燕等[14]研究发现，在肺腺癌患者组织中miR-23a-3p呈明显高表达，且与淋巴结转移、肿瘤大小及TNM 分期相关，可用于辅助诊断肺腺癌。这与本研究中miR-23a-3p的表达趋势及对患者预后的影响相似。现阶段关于miR-376c-3p的研究主要局限于细胞实验，张林等[15]在人胃肠道间质瘤GIST-T1细胞中发现，miR-376c-3p可以间接调控CASP-7的表达，抑制肿瘤细胞的增殖、迁移能力，促进肿瘤细胞凋亡，发挥抗肿瘤效应。本研究结果显示，miR-376c-3p低表达同样是结直肠癌患者预后不良的重要信号，扮演着抑瘤基因角色。

综上所述，结直肠癌患者血清miR-23a-3p表达水平明显升高，miR-376c-3p水平明显降低，且两者表达水平均对患者预后有显著影响，可作为潜在的生物学标志物。