miR-26b在肝硬化门静脉高压预后评估中的价值

张 群 李 涛 张礼杏

门静脉高压是肝硬化患者较为严重的并发症之一，可诱发食管胃底静脉曲张破裂出血、顽固性腹水、自发性细菌性腹膜炎、脾功能亢进及肝性脑病等，甚至可导致死亡[1-3]。门静脉压力在肝硬化门静脉高压患者的预后评估中具有重要意义[4]。肝静脉压力梯度与门静脉压力梯度有较高的相关性，被认为是反映门静脉压力的金标准[5-6]。但由于肝静脉压力梯度检查为有创性检查，且费用昂贵，暂未在临床上推广应用[7]。因此，探究反映肝硬化门静脉高压患者预后的生物标志物意义重大。有研究表明，miR-26b过表达可靶向人类平衡型核苷转运蛋白1，抑制Rho亚家族蛋白A/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1信号转导通路表达，降低经胆总管结扎诱导的肝硬化门静脉高压大鼠的门静脉压力，并改善肝纤维化[8]。目前关于miR-26b在肝硬化门静脉高压患者血清中的表达水平及其与预后关系的报道较少。本文对此开展研究，以期为肝硬化门静脉高压的预后评估提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年1月至2018年12月在太和县中医院确诊为肝硬化门静脉高压的127例患者作为研究对象。参照《肝硬化门静脉高压食管胃静脉曲张出血防治指南(2015)》[9]对患者进行诊断。纳入标准：(1)有慢性乙型肝炎病毒、慢性丙型肝炎病毒感染史，感染时间长于6个月；(2)首次经影像学检查或肝活组织病理学检查确诊为肝硬化，并伴有门静脉高压；(3)签署了知情同意书。排除标准：(1)门静脉高压性胃肠病；(2)严重肝、肾功能障碍；(3)合并严重感染；(4)先天性肝内胆管囊性扩张或胆道阻塞性扩张；(5)合并恶性肿瘤。127例肝硬化门静脉高压患者中男性85例，女性42例，年龄为28～70岁，平均年龄为(53.59±8.54)岁；其中慢性乙型肝炎患者114例，慢性丙型肝炎患者13例。本研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2 临床资料收集

收集受试者的年龄、性别、肝硬化病因、Child-Pugh分级、肌酐、白蛋白、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和胆红素水平。采用7600型全自动生化分析仪(日本日立公司)检测肌酐水平，采用酶联免疫吸附法检测ALT和AST水平，采用免疫比浊法检测白蛋白水平，采用钒酸盐氧化法检测胆红素水平。

1.3 血清miR-26b表达水平检测

采用实时荧光定量PCR法检测所有患者血清中miR-26b的表达水平[10]。步骤如下：(1)抽取患者晨起肘部静脉血10 mL，3 500 r/min离心15 min(离心半径8 cm)，提取离心后上清液；(2)将Trizol试剂滴加至上清液中，提取血清中总RNA；(3)用紫外分光光度计检测总RNA纯度；(4)将总RNA加至Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒中进行反转录反应，获取cDNA；(5)用PCR仪扩增cDNA，反应条件为95 ℃预变性5 min，之后95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共计40个循环。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt表示miR-26b的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 预后随访及评价

采用电话随访、复诊等方式了解肝硬化门静脉高压患者的预后情况。于患者出院后1个月开始随访，末次随访时间为2019年12月23日。本研究将食管胃底静脉曲张破裂出血、中量或高量腹腔积液(>500 mL)、自发性腹膜炎、肝性脑病及上述并发症诱发的死亡定义为预后不良。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 预后良好组与预后不良组的基本资料比较

127例肝硬化门静脉高压患者中共有53例(41.73%)预后不良，其中食管胃底静脉曲张破裂出血44例(34.65%)，中量腹腔积液5例(3.94%)，高量腹腔积液2例(1.57%)，并发自发性腹膜炎2例(1.57%)。两组患者在性别、白蛋白、ALT和AST水平方面比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。预后不良组患者的年龄、慢性丙型肝炎占比、Child-Pugh分级B级占比、肌酐和胆红素水平均高于预后不良组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 两组的基本资料比较

2.2 两组血清中miR-26b表达水平比较

预后不良组患者血清中miR-26b相对表达量为4.30±1.29，低于预后良好组(6.31±1.56)，差异有统计学意义(t=7.691，P<0.001)。

2.3 miR-26b评估肝硬化门静脉高压患者预后的价值

miR-26b评估肝硬化门静脉高压患者预后的ROC曲线下面积(AUC)为0.838(95%CI：0.762～0.898)，最大约登指数为0.520，其所对应的最佳截断点、敏感度和特异度分别为4.52、64.15%和87.84%。见图1。

2.4 影响肝硬化门静脉高压患者预后的相关因素分析

将肝硬化门静脉高压患者的预后情况作为因变量，将可能影响肝硬化门静脉高压患者预后的相关因素如年龄、肝硬化病因、Child-Pugh分级、肌酐、胆红素和miR-26b相对表达量作为自变量纳入多因素Logistic回归分析(纳入标准为单因素分析中P<0.05)，结果显示年龄、肝硬化病因、Child-Pugh分级及miR-26b相对表达量与肝硬化门静脉高压患者的预后密切相关(P<0.05)，见表3。

图1 miR-26b评估肝硬化门静脉高压患者预后的ROC曲线

表3 影响肝硬化门静脉高压患者预后的多因素Logistic回归分析

3 讨论

微RNA(miRNA)是一类由18～24个核苷酸组成的不具备编码蛋白质功能的单链RNA[11]。据报道，目前已发现多种miRNA可参与细胞的增殖、自噬、迁移及凋亡等病理生理过程[12-14]。miR-26b作为miRNA中一员，已被报道其与乳腺癌[15]、肺癌[16]、上皮性卵巢癌[17]和黑素瘤[18]等有关。Jiang等[19]研究证实了miR-26b可抑制Mcl-1基因表达，加速肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)诱导的肝癌细胞凋亡。目前关于miR-26b与肝硬化门静脉高压患者预后关系的报道较少。

本研究采用实时荧光定量PCR法检测肝硬化门静脉高压患者血清miR-26b的表达水平，发现预后不良组患者血清中miR-26b的相对表达量低于预后良好组，提示血清miR-26b的表达水平可能与肝硬化门静脉高压患者的预后密切相关。随后，本研究构建了miR-26b诊断肝硬化门静脉高压患者预后的ROC曲线，结果显示miR-26b评估肝硬化门静脉高压患者预后的ROC AUC、敏感度和特异度分别为0.838、64.15%和87.84%，提示miR-26b对肝硬化门静脉高压患者预后评估具有较高价值，特异度较高，但敏感度较低。为进一步明确miR-26b与肝硬化门静脉高压患者预后的关系，本研究采用单因素及多因素Logistic回归分析了可能影响肝硬化门静脉高压患者预后的相关因素，结果显示年龄、肝硬化病因、Child-Pugh分级及miR-26b相对表达量与肝硬化门静脉高压患者的预后密切相关。周昊等[4]研究表明年龄≥60岁或伴有慢性丙型肝炎的肝硬化门静脉高压患者的门静脉压力较高，推测患者预后不良的原因可能是年龄较大或伴有慢性丙型肝炎肝硬化，两者均会升高门静脉压力，易诱发食管胃底静脉曲张破裂出血、肝性脑病等并发症。Child-Pugh分级可反映肝脏的损伤情况，对肝硬化患者的预后评估具有重要价值[20]。miR-26b相对表达量与肝硬化门静脉高压患者的预后密切相关，推测其原因是miR-26b过表达可降低胆总管结扎诱导的肝硬化门静脉高压大鼠的门静脉压力，从而改善肝硬化[8]，其表达水平可反映肝脏损伤情况，进而预示患者预后。

综上所述，肝硬化门静脉高压预后不良患者的血清miR-26b表达水平低于预后良好者。检测肝硬化门静脉高压患者血清miR-26b表达水平有助于评估预后情况。年龄较大、患有慢性丙型肝炎、Child-Pugh分级为B级或miR-26b表达水平较低的肝硬化门静脉高压患者的预后不良风险较高。本研究的不足之处在于为单中心研究，纳入的患者均为本地区患者，可能会对研究结果造成一定偏倚，下一步将纳入多地区患者，开展多中心研究。