Hsa_circ_0012839在肝细胞癌中的表达及临床价值

关少培 罗 茜 吴建军 卞兆连

肝细胞癌(HCC)是常见的肝脏恶性肿瘤，其发病率居全球第5位，是全球男性第2位致死性疾病[1]。中国是HCC高发的国家，江苏南通等东部沿海地区是中国的HCC高发地区[2]。由于HCC起病隐匿，恶性程度高，病情进展快，极易复发及转移，故多数患者确诊时已处于中、晚期。目前HCC的病因及发病机制尚未完全明确，乙型肝炎病毒(HBV)感染、乙醇、遗传等因素都与HCC的发生、发展密切相关[3]。临床上常规对手术中切除的HCC组织标本进行p53等分子的免疫组织化学检测，以期判断预后，但这些分子的敏感度、特异度不高，预后判断效果并不理想。因此，研究HCC发生、发展的分子机制，寻找潜在的预后标志物显得尤为重要。

环状RNA(circRNA)是一类具有共价闭合环形结构的非编码RNA，因缺乏5′端和3′端，故circRNA比一般的线性RNA更稳定，不易被降解。根据基因组和序列组成的来源，circRNA分为3类：外显子circRNA(ecircRNA)、内含子circRNA(ciRNA)及外显子-内含子circRNA(EIciRNA)[4]。近年来的研究表明circRNA参与了多种肿瘤的发生、发展，包括HCC、胃癌、非小细胞肺癌、结直肠癌等[5-8]。

Hsa_circ_0012839来源于PGM1基因的第9、10号外显子，属于ecircRNA，位于chr1∶64117339-64120137，长度为319 bp。本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法分析组织、细胞中hsa_circ_0012839的相对表达水平，结合患者术后随访资料，初步分析其表达与患者生存期之间的关系，判断其作为潜在预后标志物的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

收集2013年9月至2018年3月在南通市第三人民医院肝胆外科被确诊为肝细胞癌(HCC)并经手术切除的48例患者的肿瘤组织及癌旁正常组织(距离肿瘤切缘>1 cm)，其中男性36例，女性12例，平均年龄(58.38±11.22)岁。纳入标准：经手术后病理确诊为HCC。排除标准：(1)病历资料不完整；(2)合并其他系统恶性肿瘤；(3)合并其他脏器严重功能不全；(4)随访时间<6个月。

所有组织标本离体0.5 h内浸泡于RNA later中，过夜后转移至-80 ℃保存。正常肝细胞系L-02细胞和5种HCC细胞系(Hep3B、HuH-7、Li-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1细胞)购自上海中科院干细胞库，由南通市肝病研究所培养并传代；RPMI-1640、高糖DMEM、MEM基础培养液购自美国赛默飞公司，胎牛血清购自美国Cell Sciences公司；RNAiso Plus试剂、逆转录试剂盒及SYBR Green购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

收集患者的临床资料，随访术后患者，记录患者的生存状况。所有患者均随访至2018年9月或死亡。 所有患者均签署知情同意书，本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 琼脂糖凝胶电泳

配置1%琼脂糖凝胶，室温下静置至完全凝固，移液器吸取样本加至每孔内，加样后立即通电进行电泳，电压80 V，样品由负极向正极流动，当溴酚蓝移动至距离胶板下缘1 cm时停止电泳，于紫外线下采用凝胶成像系统拍照保存。

1.3 总RNA的提取及qRT-PCR检测

使用RNAiso Plus抽提HCC组织、癌旁正常组织以及L-02、Hep3B、HuH-7、Li-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1细胞中总RNA后，应用NanoDrop-One分光光度计检测RNA的纯度和浓度。取1 μg RNA逆转录生成cDNA，根据说明书在冰上配制反应体系。轻柔混匀后进行逆转录反应，条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，冷却至4 ℃备用。

采用qRT-PCR法检测hsa_circ_0012839的相对表达水平，反应条件：第一步预变性，95 ℃ 30 s；第二步PCR，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40个循环。以GAPDH为内参，用2-△△Ct表示计算结果。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 统计学方法

本研究采用IBM SPSS Statistics 24及GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hsa_circ_0012839的成环性分析

应用背靠背、头碰头引物，通过琼脂糖凝胶电泳分析hsa_circ_0012839的成环性。背靠背引物只可扩增环状分子，头碰头引物既可扩增环状分子，也可扩增线性分子。琼脂糖凝胶电泳结果显示，hsa_circ_0012839既可被背靠背引物扩增，也可被头碰头引物扩增，而GAPDH为线性内参，只能被头碰头引物扩增，不能被背靠背引物扩增，表明hsa_circ_0012839为环状RNA。见图1。

注：背为背靠背引物，头为头碰头引物，cDNA为拷贝DNA，gDNA为基因组DNA

2.2 Hsa_circ_0012839在HCC组织及癌旁正常组织中的表达水平比较

通过qRT-PCR法测得HCC组织和癌旁正常组织中hsa_circ_0012839的表达水平分别为0.51±0.50和4.94±9.91，HCC组织中hsa_circ_0012839的表达水平低于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.000 1)。见图2。

图2 Hsa_circ_0012839在HCC组织和癌旁正常组织中的表达水平比较

2.3 Hsa_circ_0012839在细胞中的表达水平比较

通过qRT-PCR法检测细胞中hsa_circ_0012839的表达水平，结果显示，与正常肝细胞系L-02细胞相比，5种HCC细胞系Hep3B、HuH-7、Li-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1细胞中hsa_circ_0012839的表达水平均明显下降，差异均有统计学意义(P<0.01)，其中PLC/PRF/5细胞中hsa_circ_0012839的表达水平最高，Hep3B细胞中hsa_circ_0012839的表达水平最低。见图3。

注：与L-02细胞相比，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1

2.4 Hsa_circ_0012839表达与HCC患者预后的关系

根据hsa_circ_0012839的相对表达量(HCC组织/配对癌旁组织)，以比值=0.122 3为界限将HCC患者分为高表达组和低表达组。术后随访发现，与高表达组相比，hsa_circ_0012839低表达组的预后更差，差异有统计学意义(P=0.011 6)。见图4。

图4 Hsa_circ_0012839表达与HCC患者预后的关系

3 讨论

二代测序的普及推进了RNA研究领域的快速发展。CircRNA在肿瘤基因组学中备受关注[9]。研究表明circRNA通过多种途径参与细胞功能的调节。在细胞核中，由于circRNA与亲本DNA存在重复序列，故当细胞核内circRNA累积量增多时，滞留在核内的circRNA会以“负反馈”的方式与亲本DNA形成RNA︰DNA杂合链，直接阻断线性同源转录本的转录，导致可变剪接的发生，从而改变基因的表达[10]。在细胞质中，circRNA的表达也参与了细胞基因的调节。诸多研究均已证实，竞争性内源RNA(ceRNA)可在细胞质内通过充当miRNA海绵竞争性结合miRNA来调节下游基因的表达[11]。细胞质中的circRNA还可以与不同的蛋白质相互作用形成特定的circRNA，继而影响结合蛋白的作用方式，如circMbl、circFOXO3、circANRIL[12-14]。另有研究报道RNA甲基化(m6A)也可驱动circRNA翻译成多肽[15]，但翻译效率目前仍受较大限制。

在细胞外，CircRNA是很有前景的生物学标志物。CircRNA因其环状闭合抗RNase的特点而被视为非常好的生物标志物。其在某些细胞分泌的外泌体中大量存在，发挥着细胞间通信的作用[16]。尽管circRNA能否在远处组织和内环境中发挥生物学作用尚待研究，但其仍有作为潜在生物学标志物的研究价值。

近年来诸多研究表明，非编码RNA尤其是circRNA的表达失衡可影响HCC的发生、发展，circRNA在HCC的进展中起着促癌或抑癌的作用。Yu等[17]通过RNA测序发现，由于受到DExH-Box螺旋酶的调控，cSMARCA5在HCC组织中低表达，cSMARCA5低表达的患者的术后总体生存率较低，肿瘤复发率较高。体外实验证实，cSMARCA5通过海绵吸附miR-17-3p和miR-181b-5p，下调TIMP3的表达，从而抑制HCC细胞的增殖及迁移能力，提示cSMARCA5与肿瘤转移、复发有关。Zheng等[18]的研究发现，hsa_circ_0079929在HCC中低表达，过表达hsa_circ_0079929时，细胞生长受到抑制，细胞周期进展也受阻，进一步研究显示hsa_circ_0079929通过PI3K/AKT/mTOR信号转导途径抑制了细胞增殖。此外，有些circRNA在HCC中起促癌因子的作用。Huang等[19]的研究发现，circRNA-100338在HCC组织中高表达，乙型肝炎相关性HCC患者的5年生存率较低，复发转移风险较高。Wang等[20]的研究表明，circRHOT1在HCC组织中表达上调并与较差的预后有关。体内和体外研究显示，circRHOT1通过触发NR2F6的表达促进肿瘤生长和转移。上述研究表明circRNA参与HCC的多种生物学行为，circRNA具有潜在的作为生物学标志物和治疗靶点的研究价值。

本研究应用背靠背、头碰头引物，琼脂糖凝胶电泳分析结果证明了hsa_circ_0012839为环状RNA。采用qRT-PCR法检测HCC组织和癌旁正常组织中hsa_circ_0012839的表达水平，结果显示前者低于后者，差异有统计学意义(P<0.000 1)。随后采用qRT-PCR法检测了各细胞中hsa_circ_0012839的表达水平，结果显示，相比于正常肝细胞系L-02细胞，5种HCC细胞系(Hep3B、HuH-7、Li-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1细胞)中hsa_circ_0012839的表达水平均明显下降，差异均有统计学意义(P均<0.01)，其中PLC/PRF/5细胞中hsa_circ_0012839的表达水平最高，Hep3B细胞中hsa_circ_0012839的表达水平最低。回顾性分析HCC术后患者的预后情况，相比于hsa_circ_0012839高表达组，hsa_circ_0012839低表达组的预后更差，差异有统计学意义(P=0.011 6)。本研究结果表明，hsa_circ_0012839参与调控HCC的发生、发展，是判断HCC患者预后的潜在生物学标志物，但调控的具体机制有待进一步研究。