MLN4924诱导胃癌细胞MGC-803发生线粒体自噬及细胞凋亡的初步研究

邱志兵 邱冬妮 丁伟群

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，2018年全球新增确诊病例超过100万例，死亡病例约78.3万例，其为第5位常见肿瘤及第3位肿瘤相关性死因[1]。随着肿瘤诊断及多学科联合治疗的长足进步，胃癌患者的生存率显著提升，但由于胃癌具有易复发、转移、耐药的特点，故进展期患者的预后仍较差[2]。研究胃癌发生、发展的分子机制，提高早期诊断水平，开发靶向性强的药物依然任重道远。

MLN4924是靶向泛素蛋白酶体系统的第二代小分子抑制剂，它通过抑制类泛素化修饰相关重组蛋白(Neddylation)激活酶(NAE)的活性来抑制Neddylation依赖的Cullin-RING结构E3泛素连接酶(CRL)的功能，导致CRL底物累积，从而诱导细胞发生DNA损伤、细胞周期阻滞、衰老、凋亡和自噬，可显著抑制肿瘤细胞的生长[3-4]。由于CRL复合物的多个亚基在胃癌组织中高表达并与患者预后相关，此外通过检索GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=NAE1)发现NAE1在胃癌组织中高表达，故MLN4924有望成为治疗胃癌的靶向药物[5]。本研究检测MLN4924是否可诱导胃癌细胞MGC-803发生线粒体自噬及细胞凋亡，为探索MLN4924在胃癌中的作用提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 主要试验仪器

DMi3000B倒置显微镜、DMi8荧光倒置显微镜(德国Leica公司)，CyAn ADP流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)，Lightcycler 480实时荧光定量聚合酶链反应(real-time qPCR)仪(瑞士Roche公司), LAS冷光/生物发光成像分析仪(美国GE Healthcare公司)。

1.2 材料和试剂

胃癌细胞系MGC-803和HEK293T(中国科学院细胞库)， MLN4924(美国Selleckchem公司)，DMEM培养基、Opti-MEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(美国Thermo Fisher Scientific公司)，MTT细胞增殖检测试剂盒(美国Promega公司), Annexin V/7-AAD凋亡检测试剂盒、逆转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，Lipofectamine 2000试剂(美国Invitrogen公司)，总RNA抽提试剂盒(日本TaKaRa公司), RIPA中效裂解液、BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，定量聚合酶链反应(qPCR)引物合成(苏州金唯智生物科技有限公司)，LC3、p62、PINK1抗体(美国Cell Signaling Technology公司)。

1.3 细胞增殖检测

将状态良好的MGC-803细胞经胰蛋白酶消化后计数，按照每孔2 000个的细胞密度接种于96孔板中，每个待处理组设置3个复孔，培养24 h后换成含不同摩尔浓度(以下简称为浓度)MLN4924的培养基(2倍梯度稀释)。MLN4924处理48 h后，加入MTT试剂37 ℃反应4 h。DMSO终止反应后，酶标仪检测490 nm波长下的吸收光值(OD)，采用MTT法计算药物MLN4924的半数致死浓度(IC50)，筛选出最适作用浓度。

1.4 细胞凋亡检测

将MGC-803细胞接种于6孔板，每孔1×105个细胞，24 h后加入不同浓度(0、0.25、0.5、1 μmol/L)的MLN4924，与细胞作用24 h后，使用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化细胞，PBS洗涤细胞2次。使用50 μL Binding Buffer(含5 μL 7-AAD染液)重悬细胞，充分混匀后避光室温反应10 min，再加入已稀释为工作浓度的450 μL Annexin V-PE染液，充分混匀后避光室温反应10 min，上机进行流式细胞检测。

1.5 RNA提取及qPCR检测

将MGC-803细胞按照1.4所述方法接种于6孔板，培养24 h后使用不同浓度的MLN4924处理细胞，24 h后去除培养基，PBS清洗1遍后加入1 mL Trizol试剂重悬细胞，按照总RNA抽提试剂盒操作步骤抽提总RNA，利用逆转录试剂盒合成第一链cDNA，将其作为模板利用设计的特异性引物进行qPCR反应，用ACTB作为内参基因检测线粒体自噬相关重要基因LC3、p62、PINK1的转录情况。qPCR检测所用引物见表1。

表1 qPCR引物序列

1.6 蛋白免疫印迹法检测

收集经不同浓度MLN4924处理48 h后的MGC-803细胞样品，离心后在细胞沉淀中加入适量的蛋白裂解液，充分裂解细胞后离心获得蛋白上清液，BCA法进行蛋白质定量。根据qPCR检测结果筛选出差异表达的蛋白，选择合适的特异性抗体进行蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测。

1.7 自噬LC3双标慢病毒载体构建及病毒包装

查询美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站获得LC3B序列信息，通过cDNA化学合成的方法合成基因片段LC3B-stubRFP-sensGFP，用PCR法扩增出该基因片段，并与经酶切线性化的慢病毒载体通过T4连接酶连接，从而将目的基因连接到慢病毒载体Lenti-CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-PURO上，菌检获得阳性克隆并测序鉴定。取处于对数生长期状态良好的HEK293T细胞接种于细胞培养皿，待细胞密度达70%时即可用于转染，并在转染前2 h更换新鲜培养基。配制转染体系：分别将各DNA溶液(载体质粒10 μg，pHelper 1.0载体5 μg， pHelper 2.0载体5 μg)与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为500 μL；取50 μL Lipofectamine 2000试剂与450 μL Opti-MEM混合。将上述两个体系分别在室温下温育5 min。把稀释后的DNA与转染试剂混合，轻轻颠倒混匀后，室温下温育15 min。将上述转染混合物逐滴加入HEK293T细胞培养液中，轻轻摇匀，于37 ℃ 5%CO2细胞培养箱中培养。转染24 h后，用荧光显微镜观察表达示踪基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)的细胞数量判断转染效率。确定转染成功后(荧光细胞占比>70%)，收集含病毒的细胞上清液，浓缩纯化后分装，保存于-80 ℃冰箱待用。

1.8 MGC-803细胞自噬模型构建

将生长状态良好的MGC-803细胞消化重悬后计数，按照每孔1×105个细胞的密度接种于12孔板中。24 h后待其融合度达到50%，换成新鲜培养基，同时加入用PBS浓度梯度稀释的病毒液及促感染试剂Polybrene，轻轻混合均匀。8 h后弃去旧液，换上新鲜完全培养液，培养48 h后加入3 μmol/L Puromycin进行筛选，隔日使用PBS洗2遍细胞并更换新鲜完全培养基，待细胞传代后再次使用Puromycin进行筛选，扩大培养筛选后的细胞冻存留种，成功构建MGC-803-LC3B-stubRFP-sensGFP过表达稳定细胞株。

1.9 统计学处理

采用GraphPad Prism 7软件进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MLN4924对MGC-803细胞增殖的影响

为了检测药物MLN4924对高分化胃癌细胞MGC-803增殖的影响，MGC-803细胞分别与不同浓度(0、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 μmol/L)MLN4924孵育48 h。MTT分析结果显示，随着MLN4924浓度递增，MGC-803细胞存活率不断下降，MLN4924可抑制MGC-803细胞增殖，并呈剂量效应关系(图1)。 GraphPad Prism 7软件分析计算出作用48 h的MLN4924半数致死浓度(IC50)为0.182 9 μmol/L。

图1 MLN4924对MGC-803细胞增殖的影响 A 不同浓度MLN4924处理24 h和48 h的MGC-803细胞 ×100 B 不同浓度MLN4924处理的MGC-803细胞存活率

2.2 MLN4924对MGC-803细胞凋亡的影响

采用流式细胞仪检测不同浓度MLN4924处理MGC-803细胞24 h后的细胞凋亡情况。使用检测试剂盒提供的Annexin V-PE和7-AAD两种染液进行双染色，检测不同凋亡阶段细胞的比例。随着MLN4924浓度的升高，活细胞数量逐渐减少，早期和晚期凋亡细胞数量均逐渐增加，呈剂量效应关系(图2)。0.5、1 μmol/L组凋亡细胞比例(早期、晚期凋亡细胞比例之和)与0 μmol/L组(对照组)凋亡细胞比例相比，差异均有统计学意义(P均<0.000 1)。

注：与0 μmol/L组比较，***P<0.000 1图2 MLN4924对MGC-803细胞凋亡的影响 A 不同浓度MLN4924处理对MGC-803细胞凋亡的影响 B 不同浓度MLN4924处理的MGC-803细胞凋亡比例

2.3 MLN4924对LC3B、p62及PINK1基因转录的影响

根据文献报道筛选出靶基因，并依据其序列信息设计出特异的qPCR检测引物，收集不同浓度MLN4924处理的细胞样本及对照组样本，抽提总RNA，并以此为模板逆转录成cDNA，进行qPCR，结果显示不同浓度MLN4924处理24 h可不同程度地促进MGC-803细胞中LC3B、p62、PINK1基因的转录(图3)。

图3 不同浓度MLN4924处理对MGC-803细胞线粒体自噬相关基因转录的影响 A LC3B mRNA相对表达量 B p62 mRNA相对表达量 C PINK1 mRNA相对表达量

2.4 MLN4924对p62、PINK1蛋白表达的影响

Western Blot结果显示，较低浓度(0.25 μmol/L)的MLN4924处理即可显著诱导MGC-803细胞中p62蛋白的表达，PINK1蛋白表达也呈升高趋势(图4)。该结果与qPCR结果相互印证，反映出MLN4924在转录和蛋白表达层面都激活了线粒体自噬相关信号通路。此外，笔者发现较高浓度(0.5、1 μmol/L)组的p62蛋白表达水平显著低于较低浓度组(0.25 μmol/L)，推测发生该现象的原因为细胞在较高浓度药物处理条件下，p62作为一种泛素结合蛋白和选择性自噬的底物，自噬水平升高与泛素蛋白酶体途径激活，诱导p62蛋白发生降解，后续研究将探讨发生该现象的具体机制。

2.5 MLN4924对线粒体自噬的影响

利用慢病毒可高效地感染分裂细胞和非分裂细胞的特性，构建慢病毒载体质粒Lenti-LC3B-stubRFP-sensGFP，并用其感染MGC-803细胞，通过多次筛选，成功获得稳转细胞系(图5)。在该细胞系模型中，stubRFP标记可追踪LC3B，sensGFP荧光蛋白对酸性环境敏感，当溶酶体与自噬小体融合形成自噬溶酶体时，pH发生变化，sensGFP荧光发生淬灭。使用不同浓度(0、0.25、0.5、1 μmol/L)的MLN4924处理MGC-803细胞自噬LC3B双标稳转细胞系24 h后固定细胞，使用共聚焦显微镜观察并拍照。结果显示随着MLN4924浓度的升高，细胞中的红色荧光出现明显聚集，在1 μmol/L组红色荧光绝大多数呈点状分布，而绿色荧光明显衰减，提示MLN4924可诱导自噬的发生(图6)。结合2.4中Western Blot结果，可知该自噬类型主要为线粒体自噬。

图4 不同浓度MLN4924处理对MGC-803细胞线粒体自噬相关蛋白表达的影响

图5 MGC-803-LC3B-stubRFP-sensGFP稳转细胞系的共聚焦显微镜照片 ×200 A 白光视野照片 B GFP照片 C RFP照片 D B图和C图共定位照片

图6 不同浓度MLN4924处理对MGC-803细胞自噬的影响 ×200

3 讨论

MLN4924在2009年首次被提出有望作为有效的NAE抑制剂应用于抗肿瘤治疗[6]。MLN4924用于多种肿瘤细胞的临床前研究已开展，包括急性髓性白血病、肾癌、头颈癌、胃癌、肝癌、多发性骨髓瘤、恶性胶质瘤及淋巴瘤等，并针对多种实体肿瘤和血液系统肿瘤开展了临床试验，结果提示MLN4924具有较显著的抗肿瘤疗效和较低的生物学毒性[7-13]。

线粒体自噬是一种特异性自噬形式，在正常细胞中通过清除受损的线粒体维持细胞的正常代谢和能量供应[14]。线粒体自噬机制异常与多种衰老相关疾病如肿瘤、代谢综合征、神经退行性疾病等密切相关。针对不同肿瘤的多项研究显示，在不同刺激条件下激活的线粒体自噬通过不同的模式影响细胞凋亡的发生和进展。一项针对肝癌细胞的研究显示，酮康唑可诱导肝癌细胞激活线粒体自噬途径，促进线粒体过度降解，进而促进细胞凋亡的发生[15]。而一项针对宫颈癌细胞的研究显示，线粒体自噬的激活促进了肿瘤细胞生存，从而促进肿瘤细胞逃避程序性细胞死亡的发生[16]。线粒体自噬扮演的差异性角色，仍需结合具体调控机制进一步探究。PINK1/Parkin信号通路对线粒体自噬的启动和增强起着关键作用[17-18]。PINK1能促进细胞生存、转移并保护细胞对抗应激因素。敲除PINK1显著减少了肿瘤相关性表型，包括细胞增殖、克隆形成和侵袭、转移等，而回补PINK1可逆转这些变化[19]。

在本研究中，MLN4924可显著抑制胃癌细胞MGC-803的增殖，并呈剂量效应关系，其IC50约为0.182 9 μmol/L。此外，MLN4924处理24 h后可明显诱导MGC-803细胞发生凋亡，随着MLN4924浓度的升高，活细胞数量逐渐减少，早期和晚期凋亡细胞数量均逐渐增加，并且以晚期凋亡为主。

MLN4924处理MGC-803细胞24 h后，LC3B、p62及PINK1的mRNA和蛋白表达水平也明显升高，说明其在转录和蛋白表达层面都激活了线粒体自噬相关信号通路，诱导自噬发生。而在自噬LC3B双标慢病毒稳转细胞模型中，直观呈现了MLN4924处理细胞可显著诱导线粒体自噬的发生。

本课题组拟进行进一步的研究，探讨MLN4924诱导的线粒体自噬与细胞凋亡之间的关系，为MLN4924在胃癌治疗中的作用打下基础。