液体活组织检查在胰腺癌早期诊断中应用的研究进展

梅 佩 陶 京

胰腺癌是一种高度恶性的消化系统肿瘤，其起病隐匿，早期诊断十分困难。随着人们生活方式和饮食习惯的改变，胰腺癌的发病率和病死率呈上升趋势。美国癌症协会统计数据显示，胰腺癌居恶性肿瘤相关病死率第3位[1]，2015年中国统计数据显示胰腺癌病死率居恶性肿瘤第6位[2]。虽然近年来胰腺癌的诊疗技术取得了较大的进步，但其预后并未显著改善，5年生存率约为8%[1]。液体活组织检查是指通过检测体液(尤其是血液)中循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和外泌体等获得患者肿瘤病变信息，在胰腺癌的个体化诊疗中具有重要的临床应用前景。本文主要就液体活组织检查在胰腺癌早期诊断中应用的研究进展作一综述。

1 传统诊断方法

1.1 影像学检查

B超可显示肿瘤的大小及范围、周围淋巴结转移、胰胆管扩张等情况，具有简便、无创、费用低廉等优点，是目前腹部肿瘤较常用的筛查方式。B超的缺点是检查时易受脂肪、肠道气体、腹水等的影响，难以显示胰腺的全貌，在辨别小病灶及鉴别良、恶性肿瘤方面的效果不佳，因此不适用于胰腺癌的早期诊断。

CT不但可明确肿瘤，还可对胰腺周围组织侵犯、淋巴结及远处转移的情况提供有效的术前评估，是胰腺癌诊断中较常用的影像学检查方法。CT的缺点是其诊断的敏感度可能随肿瘤直径的缩小而降低，既往研究中CT诊断直径<2 cm病灶的敏感度仅为67%～77%[3]。

MRI的空间分辨率较低，对胰腺癌的诊断效能较CT差，对肿瘤可切除性的评估效能与CT类似。扩散加权成像(DWI)可发现胰腺癌小病灶，但无法鉴别肿瘤性病变和炎性病变[4]。磁共振胰胆管造影(MRCP)应用造影剂可获得胰胆管的影像，主要用于检测胰胆管扩张或狭窄情况，在胰腺癌诊断方面的作用有限。

正电子发射计算机断层显像(PET-CT)融合了功能成像与解剖成像，在肿瘤的诊断、分期及复发检测方面具有重要作用。此外，其能对病灶的代谢情况进行分析，在胰腺癌与良性病变(尤其是胰头癌与肿块型慢性胰腺炎)鉴别诊断中的作用尤为突出。然而，PET-CT的费用昂贵，不适合用于早期胰腺癌的筛查。

超声内镜(EUS)，特别是超声引导下的细针穿刺活组织检查技术(EUS-FNA)，与其他影像学检查相比，EUS-FNA可获得组织标本而具有独特的诊断价值。由于EUS-FNA具有侵入性，因此不适合作为胰腺癌的首选检查方法。此外，经内镜逆行胰胆管造影(ERCP)常用于放置自膨式支架来引流胆汁，目前认为其在胰腺癌早期诊断方面的价值不大。

1.2 肿瘤标志物

糖类抗原19-9(CA19-9)是胰腺癌标志物，其诊断胰腺癌的敏感度为79%～81%，特异度为82%～90%[5]，但在急性胰腺炎、慢性胰腺炎、梗阻性黄疸、肝硬化及胃肠道肿瘤患者中会出现假阳性，而在Lewis抗原阴性的胰腺癌患者中会出现假阴性，因此临床上CA19-9不用于胰腺癌早期诊断，而常用于评估疗效及检测术后复发情况[6]。癌胚抗原(CEA)在胰腺癌、胃癌、结直肠癌患者中表达均升高，其对胰腺癌的诊断特异度较低[7]。此外，其他肿瘤标志物(如CA242、CA50、CA72-4等)单独用于诊断胰腺癌的敏感度和特异度不高，故临床上不常用。

2 液体活组织检查

2.1 循环肿瘤细胞

2.1.1 生物学特性 1869年澳大利亚籍医生Ashworth在尸检乳腺癌患者时，在血液中发现了与原发肿瘤细胞相似的细胞，从而提出了循环肿瘤细胞(CTC)的概念——由原发灶或转移灶脱落进入外周血的肿瘤细胞。CTC可能经历了上皮间质转化(EMT)，具有更强的流动性和侵袭性，更易黏附于血管壁进而穿透进入血液循环，是肿瘤发生转移的重要原因。CTC具有完整性，不仅包含肿瘤的DNA信息，还包含基因组、蛋白质组等信息，是研究肿瘤组织信息的来源[8]。此外，对CTC进行细胞培养后还可以进行功能性研究[9]。

2.1.2 检测技术 CTC的检测方法主要分为利用其物理学特性(如大小、密度等)的直接分离法，以及利用其免疫学特性(如上皮细胞黏附分子、特异性抗体等)的间接分离法。目前CTC的主流检测技术主要包括：OncoQuick(基于细胞密度分离CTC)、ISET(依据细胞大小使用孔径8 μm滤膜分离CTC)、MACS(通过免疫磁珠标记分离上皮型CTC)、CellSearch(使用EpCAM抗体包被的铁磁珠进行免疫分离)、IFISH-CTC(免疫荧光染色结合FISH技术进行非血缘性细胞染色体异常检测)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR，基于肿瘤特异性基因的表达分析)、AdnaTest(通过特定抗原表达和肿瘤相关标志物分离，提取RNA进行RT-PCR分析)、CTC-chip(使用含包被EpCAM抗体微柱阵列的芯片)[9-13]。其中，仅有Immunicon公司的CellSearch检测系统于2004年通过美国食品和药品管理局(FDA)认证，也是唯一通过FDA批准用于临床的CTC检测系统[14]。CellSearch虽然准确度较高，但在某些良性和炎性疾病中可能出现假阳性[10]。由于存在EMT，基于EpCAM的富集技术也可能会导致较高的假阴性率。目前该系统尚未被批准用于胰腺癌的诊断。

2.1.3 在胰腺癌早期诊断中的应用 CTC在肿瘤早期诊断中的价值已在多种肿瘤的研究中得到证实。研究发现，早在CT发现肺癌之前的1～4年，CTC就可在患者血清中检测到[15]。美国临床肿瘤学会(ASCO)已批准将CTC作为乳腺癌标志物，为乳腺癌早期诊断提供了新的选择[16]。Rhim等[17]在胰腺癌小鼠模型中发现，在肿瘤发展过程的前期，一些胰腺细胞发生了EMT，这些细胞被认为是早期的肿瘤细胞。在恶变之前，胰腺囊性病变患者的血液样本中可检测到胰腺上皮细胞。上述研究结果表明CTC早于原位肿瘤形成，并有望成为胰腺癌早期诊断的肿瘤标志物。

CTC特异性基因表达可作为肿瘤早期诊断的替代标志物，这类研究主要通过检测其表达的上皮蛋白从而检测CTC。如Soeth等[18]检测了胰腺癌患者骨髓和静脉血中的细胞角蛋白20(CK20)，发现高水平的CK20与国际抗癌联盟(UICC)的肿瘤分期相关。Zhang等[19]将CK、CD45、DAPI和荧光原位杂交(FISH)的免疫染色与第8号染色体着丝粒探针(CEP8)方法联合应用，提高了对胰腺癌CK弱或阴性的CTC和二倍体CTC的鉴定效能。CTC可作为早期胰腺癌患者、无症状患者及CA19-9正常患者诊断胰腺癌的标志物。Xu等[20]对40名患者采用了类似方法，当以CTC≥2个/7.5 mL和CA19-9>37 μmol/L为界值时，胰腺癌的诊断率达97%。此外，CTC的另一种标志物双肾上腺皮质激素样激酶1(DCLK1)也可能可以用于胰腺癌的早期诊断。Qu等[21]发现TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌患者的DCLK1水平升高，而Ⅲ期和Ⅳ期患者则下降。尽管CTC在胰腺癌早期诊断中具有较大的潜在价值，但由于CTC数量稀少，因此从血液中捕获CTC的技术难度较高，从而限制了其临床应用。此外，CTC的特异度较低，患者的个体化差异较大。根据肿瘤类型、疾病分期和其他因素，CTC可能表达不同的表面标志物，即使同一患者也存在异质性。目前尚缺乏统一的研究方法，并且有待大样本研究进一步探讨其临床应用价值。

2.2 循环肿瘤DNA

2.2.1 生物学特性 1948年Mandel和Metais首次在人类血液中发现了细胞外游离核酸，即循环DNA的存在。1977年Leon等在肿瘤患者血清中发现了循环肿瘤DNA(ctDNA)。1983年Shapiro等[22]首次在胰腺癌患者血液中检测出ctDNA。研究表明ctDNA主要来自于坏死的肿瘤细胞、凋亡的肿瘤细胞、CTC和肿瘤细胞分泌的外泌体[23]。ctDNA长度约为134～144 bp，半衰期约为2 h，可在血液、唾液、尿液等多种体液中检出[9,23]。ctDNA包含肿瘤细胞特异性突变的基因信息，通过对这些重要DNA片段捕获测序可获得肿瘤特异性突变信息，有助于诊断和指导个体化用药。

2.2.2 ctDNA的检测技术 ctDNA检测技术目前主要为数字聚合酶链反应(dPCR)、BEAMing技术、标记扩增深度测序(TAM-Seq)、癌症个体化深度测序(CAPP-Seq)。ctDNA的检测平台目前有二代基因测序和数字化PCR，可分别对ctDNA的序列信息和序列数量进行检测，适用于非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、皮肤癌等常见肿瘤，检测的靶基因多以KRAS、PTEN、EGFR、BRAF等热门基因为主。2016年4月FDA批准了Epigenomics公司以血液为基础筛查结直肠癌的EpiproColon技术，EpiproColon(Septin9基因甲基化检测试剂盒)能检测血液中Septin9基因V2区域发生甲基化的CpG岛bisDNA序列，这是FDA批准的第一款基于ctDNA进行肿瘤筛查的产品[9,12-13,24]。

2.2.3 在胰腺癌早期诊断中的应用 研究显示，超过90%的胰腺上皮内瘤变患者存在KRAS基因突变，并且KRAS基因突变率与胰腺上皮内瘤变级别直接相关[22]，检测ctDNA中的KRAS突变有望应用于胰腺癌的早期诊断。Bettegowda等[25]采用dPCR技术检测来自640例不同类型和不同分期的肿瘤患者血清中的ctDNA，其中包括155例胰腺癌患者，结果显示局限性胰腺癌患者的ctDNA检出率为48%，并且ctDNA检出率随着肿瘤临床分期增加而升高。与此相似，Sausen等[26]发现在51例可切除胰腺癌患者中，ctDNA检出率为43%。然而，目前一些研究表明慢性胰腺炎患者(10%～15%)也会发生KRAS突变，联合检测KRAS突变和血清CA19-9可提高诊断胰腺癌的敏感度(98%)和特异度(77%)[27-28]。此外，研究发现ctDNA的甲基化分析也可作为胰腺癌的潜在标志物，以区分慢性胰腺炎和胰腺癌[29]。虽然ctDNA为胰腺癌早期诊断提供了一种可能性，但现有技术的敏感度不高，检测方法的标准化仍有待解决。

2.3 外泌体

2.3.1 生物学特征 1983年外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年被Johnstone等命名为“exosome”。外泌体是由细胞分泌出的小泡，其含有蛋白质、DNA、mRNA以及微RNA(miRNA)等，是细胞之间沟通的载体。研究发现外泌体与肿瘤的发生、发展、转移及抗药性有一定的相关性。肿瘤细胞以这些小泡为载体，帮助其躲避免疫系统的监视，而这些小泡既可为肿瘤细胞转移指引方向，可也创造适合肿瘤生长的微环境[30]。

2.3.2 外泌体的检测技术 目前已有许多技术被开发用于外泌体的分离，如超速离心法、过滤法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、磷脂酰丝氨酸亲和法、色谱法等。分离后的外泌体可采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)、RT-PCR、核算测序、酶联免疫吸附测定(ELISA)或其他可商购的试剂盒用于检测蛋白质和RNA水平[13,31-32]。目前分离技术仍面临以下挑战：(1)缺乏标准化技术及特异性标志物以区分肿瘤来源和非肿瘤来源的外泌体；(2)易受其他细胞外囊泡及细胞碎片影响，难以分离高纯度的外泌体；(3)技术操作耗时，难以应用到临床实践中。

2.3.3 在胰腺癌早期诊断中的应用 外泌体在癌变过程中被大量分泌，不同于肿瘤坏死细胞释放的ctDNA，外泌体是由活细胞分泌的，因此外泌体可更早地在血液中被检出，更适用于胰腺癌的早期诊断[33]。血清外泌体来源的蛋白质或miRNA可能可以作为合适的候选标志物，如胰腺肿瘤起始细胞(PCIC)蛋白标志物(CD44v6、Tspan8、EPCAM、CD104)及miRNA(miR-1246、miR-4644、miR-3976、miR-4306)，这些蛋白质和miRNA在胰腺癌患者血清外泌体中的表达显著上调，联合检测这些蛋白质和miRNA可有效提高胰腺癌诊断的敏感度[34]。此外，有研究表明外泌体来源的DNA突变(如KRAS、TP53)检测也可用于胰腺癌诊断，并且诊断效能优于CTC，但外泌体KRAS突变也可发生于健康人[35]。有研究表明，一种外泌体膜蛋白磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC-1)可区分胰腺癌患者、慢性胰腺炎患者及健康人，特异度和敏感度均达100%[36]。上述研究结果都表明，外泌体有望成为胰腺癌早期诊断的理想标志物，但仍需大量研究进一步证实。

3 结语

胰腺癌恶性程度较高，早期诊断十分困难，亟需寻找有效的诊断标志物。液体活组织检查是“精准医疗”的代表性诊断技术，与传统的手术活组织检查和穿刺活组织检查相比，其优势在于：(1)不良反应少，为非侵入式检查；(2)操作简单，无需影像学支持；(3)可重复取样；(4)可有效应对肿瘤异质性；(5)发现早于影像学检测；(6)成本较低。除了早期诊断，循环肿瘤标志物在评估肿瘤负荷、预测预后、监测复发、指导用药等方面的研究也有显著的进展，本文中未详细陈述。尽管液体活组织检查在一定程度上解决了传统技术的部分局限性，但目前尚不足以替代传统检查，可将其作为传统检查方法的补充，未来尚需大规模的临床研究验证。