miR-542-3p过表达对葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎大鼠的作用及机制初探

金鸿锋 李彬彬 张 微

溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性非特异性炎性肠道疾病，临床症状主要为腹痛、腹泻和脓血样便，严重影响着人们的健康[1-2]。UC易复发，若不及时进行干预，易发生中毒性巨结肠、结肠大出血等并发症[3]。近年来，随着糖皮质激素、5-氨基水杨酸及免疫抑制剂的应用，UC患者的病死率已明显降低；但长期应用上述药物会产生不良反应，并且会影响疗效[4]。因此，探究UC的发病机制，并针对其机制研发靶点药物具有重要意义。Toll样受体4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)通路是参与UC发病和病情进展的主要通路之一，可促使大量炎性细胞因子释放，从而加重结肠组织的炎性反应[5-7]。有研究证实miR-542-3p可通过调控TLR4/NF-κB信号通路，抑制癫痫大鼠P-糖蛋白表达，从而减轻癫痫引起的脑部损伤[8]。但目前关于miR-542-3p是否可通过调控TLR4/NF-κB信号通路治疗UC的报道较少。本研究探讨了miR-542-3p过表达对UC大鼠的作用及机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

44只SD大鼠，SPF级，雌雄各半，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[动物生产许可证号：SCXK(湘)2016-0002]。适应性饲养1周，环境温度为24～26 ℃，湿度为50%～70%，昼夜交替间隔为12 h。

1.2 试剂与仪器

BCA蛋白定量试剂盒、苏木精-伊红(HE)染色试剂盒、葡聚糖硫酸钠(DSS)均购自北京孚博生物科技有限公司；JA11002B型电子天平购自上海精科实业有限公司；SuPerMax 3000AL型多功能酶标仪购自上海闪谱生物科技有限公司；RM2016病理组织切片机购自上海徕卡仪器有限公司；DYCP-31C型琼脂糖水平电泳仪及配套电泳槽购自北京六一生物科技有限公司。

1.3 UC模型构建及分组

从44只SD大鼠中随机抽取10只作为正常组，给予蒸馏水饲养；其余34只大鼠给予3% DSS水溶液饲养，自由饮用，共饲养6 d。之后从34只大鼠中随机抽取4只，取结肠组织行HE染色，判断UC大鼠模型是否构建成功。将造模成功的30只大鼠随机分为模型组、空载体组和过表达组，每组各10只。其中空载体组分别于饲养第7天和第14天时尾静脉注射含空载质粒的慢病毒，过表达组分别于饲养第7天和第14天时尾静脉注射含过表达miR-542-3p质粒的慢病毒[9]。模型组在实验过程中有1只大鼠死亡。

1.4 UC疾病活动指数评估

从大鼠体质量变化、粪便性状及血便这3个维度进行UC疾病活动指数(DAI)评估[10]。体质量变化评估：稳定计0分，下降幅度为1%～5%计1分，下降幅度为5%～10%计2分，下降幅度为10%～15%计3分，下降幅度>15%计4分。粪便性状评估：正常计0分，松散计2分，稀水样便计4分。血便评估：无血便计0分；粪便隐血试验结果呈阳性计2分；肉眼可见血便计4分。以上3个维度评分总和即为DAI评分。

1.5 UC组织HE染色

环形切取大鼠结肠组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片、脱蜡，HE染色，显微镜下观察结肠组织的病理结构、腺体排列、炎性细胞浸润情况、溃疡深度等[11]。

1.6 指标检测

应用2%戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，然后断头处死，抽取各组大鼠心脏静脉血5 mL，室温下4 000 r/min离心10 min，离心半径8 cm，离心后提取上层清液，保存于-20 ℃冰箱中待测。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组大鼠血清白细胞介素-4(IL-4)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，实验所需试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。

取各组大鼠结肠组织，采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time qPCR)法检测结肠组织中miR-542-3p的相对表达量[12]。实验步骤：(1)取结肠组织，在液氮中研磨，研磨后以4 000 r/min离心15 min，离心半径8 cm，取上清液，保存于-20 ℃冰箱中待测；(2)应用TRIzol试剂提取结肠组织中的总RNA；(3)使用紫外分光光度计检测总RNA纯度，若OD值范围在1.75～1.95，则继续后续实验；(4)取2 μg总RNA，用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒进行反转录反应，生成cDNA；(5)使用PCR扩增仪进行扩增反应，反应条件为95 ℃预变性2 min，之后95 ℃ 10 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，共40个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt计算miR-542-3p的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

取各组大鼠结肠组织，采用蛋白质免疫印迹法检测结肠组织中TLR4和NF-κB的表达水平[13]。实验步骤：(1)取结肠组织，滴加RIPA裂解液，提取结肠组织中的总蛋白；(2)用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量；(3)电压80 V凝胶电泳15 min，然后调整至120 V，直至溴酚蓝跑出胶面；(4)300 mA转膜60 min；(5)5%脱脂奶粉封闭2 h，滴加一抗，4 ℃孵育过夜；(6)TBST漂洗，滴加二抗，室温下孵育2 h；(7)曝光显影，用ImageJ 1.8.0软件分析结果。兔抗鼠TLR4单克隆抗体、兔抗鼠NF-κB单克隆抗体和兔抗鼠β-actin单克隆抗体均购自美国Abcam公司。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 各组DAI评分比较

正常组、模型组、空载体组和过表达组的DAI评分分别为(1.61±0.37)分、(7.14±1.42)分、(7.18±1.38)分和(3.02±1.06)分。与正常组比较，模型组DAI评分升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组和空载体组比较，过表达组DAI评分降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 各组结肠组织病理学变化

由图1可知，正常组的结肠组织结构完整，无炎性细胞浸润；模型组和空载体组黏膜层不完整，溃疡面已深达肌层，腺体排列不规则，有大量炎性细胞浸润；过表达组黏膜层缺损程度、溃疡深度、腺体排列及炎性细胞浸润情况等均较模型组和空载体组有所改善。

图1 各组结肠组织病理组织学检查结果 HE染色 ×400 A 正常组 B 模型组 C 空载体组 D 过表达组

2.3 各组结肠组织中miR-542-3p相对表达量比较

正常组、模型组、空载体组和过表达组miR-542-3p的相对表达量分别为1.01±0.07、0.42±0.09、0.39±0.11和1.85±0.10。与正常组比较，模型组miR-542-3p的相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组和空载体组比较，过表达组miR-542-3p的相对表达量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 各组血清IL-4和TNF-α表达水平比较

与正常组比较，模型组IL-4和TNF-α表达水平均升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与模型组和空载体组比较，过表达组IL-4和TNF-α表达水平均降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 各组IL-4和TNF-α表达水平比较()

2.5 各组结肠组织中TLR4和NF-κB表达水平比较

与正常组比较，模型组TLR4和NF-κB的表达水平均升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与模型组和空载体组比较，过表达组TLR4和NF-κB的表达水平均降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表3、图2。

表3 各组结肠组织中TLR4和NF-κB表达水平比较()

图2 各组结肠组织中TLR4和NF-κB的表达水平

3 讨论

微RNA(miRNA)是一类由18～24个核苷酸组成的单链非编码蛋白质的RNA。目前已有大量研究证实miRNA可调控细胞的增殖、转移、迁移、自噬及凋亡等病理生理活动，并在疾病诊断、严重程度评估、预后评价方面有一定参考价值[14-17]。miR-542-3p作为miRNA中一员，已被报道参与了肝细胞癌[18]、黑色素瘤[19]、食管癌[20]、骨肉瘤[21]及脑胶质瘤[22]等疾病的发生及进展。但目前关于miR-542-3p与UC发病关系的报道较少。

本研究通过比较4组结肠组织中miR-542-3p的相对表达量，发现模型组结肠组织中miR-542-3p的相对表达量低于正常组，提示miR-542-3p与UC发病有关。过表达组结肠组织中miR-542-3p的相对表达量高于模型组，提示过表达miR-542-3p成功，可继续后续研究。DAI评分是评价UC疾病活动情况的重要指标。本研究通过比较各组大鼠DAI评分，发现过表达组大鼠DAI评分低于模型组和空载体组，表明miR-542-3p过表达可抑制DSS诱导的大鼠体质量降低，并改善UC大鼠粪便性状和血便，对UC大鼠有一定保护作用。IL-4是Th2型细胞因子，在免疫应答反应中发挥着重要作用[23]。若机体IL-4水平失调，会引起一系列炎性反应，可损伤组织和器官[24]。TNF-α可促使炎症性肠病发病，其机制与其可增强炎性反应有关[25]。UC患者的结肠组织会释放大量炎性细胞因子，通过损伤结肠黏膜上皮细胞，破坏机体肠道免疫屏障，从而促进UC进展。本研究通过比较各组血清IL-4、TNF-α的表达水平，发现过表达组血清IL-4、TNF-α水平低于模型组和空载体组，提示miR-542-3p过表达对DSS诱导的UC大鼠的炎性反应有一定抑制作用。

有研究表明TLR4对肠黏膜先天防御反应有一定调节作用，可维护肠黏膜和肠道微生态平衡[26]。TLR4可通过靶向NF-κB调控炎性细胞因子水平，从而参与多种疾病的发生过程，如非酒精性脂肪性肝病[27]、克罗恩病[28]及UC等。本研究通过比较各组结肠组织中TLR4和NF-κB的表达水平，结果发现过表达组结肠组织中TLR4和NF-κB表达水平均低于模型组和空载体组，提示miR-542-3p过表达对TLR4和NF-κB水平有一定调节作用。基于上述结果，推测过表达miR-542-3p可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，下调IL-4、TNF-α的表达水平，从而发挥保护作用。

综上所述，miR-542-3p过表达可改善UC结肠组织的病理状态，减轻炎性反应，其保护机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。本研究仅验证了miR-542-3p过表达对UC大鼠TLR4/NF-κB信号通路的影响，下一步将对与UC发病有关的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路、Notch信号通路、趋化因子信号通路等进行验证，以弥补本研究的不足。