姜黄素通过调控miR-425表达对炎症性肠病大鼠炎性反应的影响研究

宋 巍 黄 蕊 朱 飞 李 明

炎症性肠病(IBD)是慢性非特异性炎性疾病，可累及回肠、结肠和直肠，包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)，疾病活动期的主要临床表现为反复出现腹痛、腹泻或血便[1-2]。目前IBD的发病机制尚不完全清楚，学术界认为遗传、免疫、炎性反应、精神心理因素等共同作用诱发了肠道的非特异性炎性反应[3]。炎性反应与IBD的发生、发展及病情轻重密切相关，抑制IBD活动期炎性反应是改善病情的有效手段。姜黄素对于炎性反应和免疫反应具有调控作用，且不良反应较少，安全性较高，已被研究证实可缓解IBD病情[4-6]。由于IBD发病机制复杂，姜黄素缓解IBD病情的具体机制尚不完全清楚。微RNA(microRNA)也可通过多种方式调控IBD的炎性反应和免疫反应，进而影响IBD病情[7]。研究发现CD4+T细胞亚群即辅助性T细胞17(Th17细胞)、调节性T细胞(Treg细胞)与 IBD发病有重要关系，维持Treg/Th17细胞分化平衡是保持肠道免疫稳态并治疗IBD的重要因素[6-7]。近年的研究发现，姜黄素和miR-425均可通过调控Th17细胞(CD4+IL-17A+)细胞占CD4+T细胞的百分比和Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+)占CD4+T细胞的百分比来影响IBD的炎性反应[8-9]。目前姜黄素是否能通过调控miR-425表达水平进而影响Th17细胞、Treg细胞百分比，并进一步影响IBD的炎性反应和病情尚不清楚。本研究分析了姜黄素对于IBD大鼠的miR-425表达水平、Th17细胞和Treg细胞百分比及炎性反应的调控作用，以期为IBD的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30只成年雄性SD大鼠(8～10周龄，250～300 g)由本院实验动物中心提供。大鼠在本院实验室饲养，昼夜交替间隔为12 h，温度(21.0±2.0)℃，湿度50%～55%，并给予足够的水和食物。采用随机数字法将30只大鼠随机分为对照组、IBD组和IBD+姜黄素组，每组10只。本研究经医院实验伦理委员会批准。

1.2 主要试剂和仪器

本研究主要试剂：制备IBD大鼠模型的三硝基苯磺酸(TNBS)(美国Sigma公司)；检测miR-425表达水平的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)；检测白细胞介素-6(IL-6)、IL-17和转化生长因子-β(TGF-β)表达水平的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(英国Abcam公司)；检测Th17细胞、Treg细胞百分比的流式细胞术(FCM)所需抗体CD4、CD25、IL-17A和Foxp3(英国Abcam公司)；淋巴细胞分离液(美国MP Biomedicals公司)；流式细胞仪(美国BD公司)。

1.3 IBD模型制备和姜黄素干预

将5%TNBS溶液与无水乙醇以1∶1的比例制备成混合液。将大鼠用20 g/L戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔注射的方法麻醉，用直径为2 mm的硅胶管从肛门插入肠道8 cm，把配制的TNBS混合液(50 mL/kg)从硅胶管注入肠道；对照组注入等量的15%乙醇溶液。将处理后大鼠的肛门夹闭并倒立1 min，其后常规饲养。制备IBD模型后第1 d，IBD+姜黄素组每日给予姜黄素(100 mg/kg)灌胃，对照组每日给予蒸馏水(100 mg/kg)灌胃，连续灌胃7 d。

1.4 疾病活动指数量表评分

参照文献[10]报道的方法，利用疾病活动度指数(DAI)量表评估大鼠的IBD病情，具体方法：每日观察大鼠的体质量、大便性状和隐血情况，计算每只大鼠的DAI评分。DAI总分为4分，评分标准：大鼠体质量下降1%～5%、大便松散且隐血阳性记为1 分；大鼠体质量下降6%～10%、大便松散且隐血阳性记为 2 分；大鼠体质量下降11%～15%、大便松散且隐血阳性记为 3 分；大鼠体质量下降>15%、大便表现出稀便且肉眼可见血便记为 4 分。DAI评分越高表示病情越重。

1.5 外周血获取和单个核细胞分离

大鼠经过姜黄素干预和喂养7 d后，采集各组的静脉血6 mL，其中1 mL用于PCR检测miR-425的表达水平，1mL用于ELISA检测促炎因子IL-6、IL-17及抑炎因子TGF-β表达水平；4 mL用于FCM检测Th17细胞、Treg细胞百分比。将静脉血在室温下与等量 RPMI1640混匀，然后立即采用淋巴细胞分离液和密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞(PBMC)，以备后续FCM使用。

1.6 RT-PCR检测miR-425表达水平

采用RT-PCR检测大鼠外周血中miR-425表达水平，引物序列见表1。具体步骤：首先利用Trizol试剂并参照说明书提取静脉血中的总RNA，利用OD260/OD280比值来定量RNA。每个标本取1 μg RNA用于逆转录为cDNA，每1 μL cDNA用于RT-PCR检测，内参为β-actin。具体的操作步骤按照说明书进行。PCR的反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环，72 ℃延伸7 min。每份标本检测3次，取平均值作为最终结果。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.7 ELISA检测促炎和抑炎因子水平

取静脉血1 mL，3 000 r/min离心10 min，静置后获取上层血清，保存于-40 ℃待测。采用ELISA试剂盒检测大鼠血清中促炎因子IL-6、IL-17和抑炎因子TGF-β的表达水平，检测方法严格按照试剂盒说明书进行。每份标本检测3次，取平均值作为最终结果。

1.8 FCM分析Th17细胞和Treg细胞百分比

将大鼠外周血PBMC重悬于含有10%胎牛血清的流式洗液中，以制备PBMC悬液。用CD4、CD25、IL-17A、Foxp3抗体检测Th17细胞、Treg细胞百分比。避光条件下，将前述抗体加入大鼠PBMC悬液中，避光、室温孵育2 h，离心后祛去上清，加入反应终止液，离心后再祛去上清。用PBS清洗3次，重悬于含10%胎牛血清的流式洗液中，在流式细胞仪上进行检测，分析Th17细胞、Treg细胞百分比。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 各组外周血中miR-425表达水平的比较

对照组、IBD组、IBD+姜黄素组大鼠静脉血中miR-425相对表达水平分别为1.13±0.14、2.45±0.29、1.47±0.18。与对照组相比，IBD组miR-425表达水平升高；与IBD组相比，IBD+姜黄素组miR-425表达水平降低；3组的差异有统计学意义(P=0.002)。该结果提示姜黄素可降低IBD大鼠外周血中miR-425的表达水平。

2.2 各组外周血中Th17细胞、Treg细胞百分比的比较

与对照组相比，IBD组静脉血中Th17细胞百分比升高，Treg细胞百分比降低；与IBD组相比，IBD+姜黄素组静脉血中Th17细胞百分比降低，Treg细胞百分比升高；3组的差异均有统计学意义(P<0.001，P=0.008)。该结果提示姜黄素干预可降低IBD大鼠外周血中Th17细胞百分比，并可提高Treg细胞百分比。见表2。

表2 各组外周血中Th17细胞、Treg细胞百分比的比较/%

2.3 各组外周血中促炎和抑炎因子表达水平的比较

与对照组相比，IBD组静脉血中促炎因子IL-6、IL-17表达水平升高，抑炎因子TGF-β表达水平降低；与IBD组相比，IBD+姜黄素组静脉血中IL-6、IL-17表达水平降低，TGF-β表达水平升高；3组的差异均有统计学意义(P=0.001，P<0.001、P<0.001)。该结果提示姜黄素可降低IBD大鼠外周血中促炎因子IL-6、IL-17的表达水平，并可提高抑炎因子TGF-β的表达水平。见表3。

表3 各组外周血中促炎和抑炎因子表达水平的比较/pg·mL-1

2.4 各组DAI评分比较

对照组DAI评分为0，IBD组为4.04±0.42，IBD+姜黄素组为1.87±0.25。与对照组相比，IBD组的DAI评分升高；与IBD组相比，IBD+姜黄素组的DAI评分降低；3组的差异有统计学意义(P=0.004)。该结果提示姜黄素可降低IBD大鼠的DAI评分。

3 讨论

本动物实验分析了姜黄素对IBD大鼠外周血中miR-425表达水平、Th17细胞和Treg细胞百分比，以及促炎和抑炎因子表达水平的调控作用。结果显示，IBD大鼠外周血中miR-425表达水平、Th17细胞百分比、IL-6和IL-17表达水平、DAI评分升高，而Treg细胞百分比和TGF-β表达水平降低；采用姜黄素处理后，IBD大鼠外周血中miR-425表达水平、Th17细胞百分比、IL-6和IL-17表达水平、DAI评分降低，而Treg细胞百分比和TGF-β表达水平升高。上述结果提示姜黄素可通过下调miR-425表达水平来调整Th17细胞和Treg细胞百分比，进而减轻IBD大鼠的炎性反应并缓解病情。

肠道免疫反应、炎性反应在IBD的发病机制中发挥着重要作用，其中肠道免疫失衡是关键环节。近年来Th17细胞、Treg细胞及两者之间的平衡成为研究热点，研究表明Th17细胞和Treg细胞免疫平衡与IBD发病密切相关[6]。Th17细胞是可以分泌IL-17的CD4+T细胞亚群，IL-6和TGF-β可共同启动CD4+T细胞向Th17细胞分化；TGF-β可通过促进Foxp3表达诱导CD4+T细胞分化为具有黏膜保护作用的Treg细胞，从而引发级联炎性反应[11-13]。因此，寻求可以调整Th17细胞和Treg细胞免疫平衡的有效方法对于缓解IBD病情具有积极意义。姜黄素是一种具有初级药物活性的中药单体，对于炎性反应和免疫反应具有重要的调控作用，其不良反应较少，安全性较高，且已被研究证实可缓解IBD病情[4-6]。研究显示姜黄素对于Th17细胞和Treg细胞的免疫平衡具有调控作用，说明姜黄素具有通过调整免疫反应来治疗IBD的潜能。microRNA是一种短链非编码RNA，可调控许多生物学过程，肠道免疫反应和炎性反应也与其密切相关[14]。miR-425能调控Th17细胞和Treg细胞的免疫平衡，研究发现miR-425在IBD活动期的表达水平升高，其通过下调靶基因 Foxo1促进Th17细胞分化，加重TNBS诱导的小鼠结肠炎的疾病严重程度[15]。基于上述文献回顾，本研究旨在探讨姜黄素能否通过调控miR-425表达水平来改变Th17细胞、Treg细胞百分比，进而影响IBD的炎性反应和病情。结果显示，姜黄素可降低IBD大鼠外周血中miR-425表达水平及Th17细胞百分比，提高Treg细胞百分比，降低促炎因子IL-6、IL-17表达水平和DAI评分，提高抑炎因子TGF-β表达水平，说明姜黄素可通过下调miR-425表达水平来减轻IBD大鼠的炎性反应和缓解病情。

综上所述，本研究初步探讨了姜黄素通过调控miR-425的表达水平对IBD大鼠炎性反应和病情轻重的影响。研究结果显示姜黄素具备调控IBD大鼠Th17细胞百分比和Treg细胞百分比、减轻炎性反应和病情轻重的潜能。本研究为探索IBD治疗新策略提供了初步理论参考，具有一定的临床意义。