肝组织中ARID4B和DSN1蛋白表达水平在肝细胞癌患者预后评估中的价值

闫春伟 田立蕊 张 璐

肝细胞癌(HCC)是肝脏恶性肿瘤，是全球第5位肿瘤相关死因[1-2]。HCC的主要治疗方法包括肿瘤切除、射频消融和肝移植[3-4]。然而，传统疗法对于晚期HCC仍然无效[5]。研究表明HCC的侵袭和转移与某些基因密切相关[6]。因此，研究在HCC发生、发展中起关键作用的基因非常重要，这些基因可能是HCC潜在的生物学标志物或治疗靶点，可能有助于改善患者的预后。

富含AT的相互作用域4B(ARID4B)是ARID家族的成员[7]。ARID4B蛋白在乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和卵巢癌及正常睾丸中高表达，但在其他正常组织中的表达受到限制。研究表明ARID4B能促进乳腺癌的侵袭和转移[8]，并可作为原发性脑肿瘤中肿瘤行为的预测因子[9]。但ARID4B在白血病中起抑癌作用[10]。Mis12复合体是着丝点的结构组成部分，在纺锤体微管纤维与有丝分裂染色体的连接中起着重要作用[11]。Nnf1的剂量抑制因子(DSN1)在调节Mis12复合物的组装过程中起关键作用。近年的一项研究表明，DSN1可影响细胞周期进展，并与结直肠癌患者的临床病理特征密切相关[12]。

目前ARID4B和DSN1是否在HCC中起特定作用尚不清楚。本研究评估了ARID4B和DSN1在HCC组织和邻近非癌肝组织(ANLT，距离肿瘤边缘1 cm)中的表达水平，并探索其与HCC患者的临床病理特征、总体生存率及无病生存率的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究选取130例经37%甲醛溶液固定、石蜡包埋的HCC组织样品，以及新鲜冷冻的130对HCC组织和ANLT样品。所有样本均取自2016年6月至2017年6月在秦皇岛市第三医院外科接受肝切除手术且术前未行化学治疗或放射治疗的HCC患者。所有HCC患者均经病理确诊。记录所有患者临床病理特征的详细信息。术后对患者进行为期2年的随访，每半年对患者或其家属进行电话随访，随访截止时间为2019年7月1日。本研究中，总生存期(OS)定义为手术至死亡或最后一次随访的时间，无病生存期定义为手术至任何形式的复发的时间。所有患者均签署知情同意书，本研究经医院伦理道德委员会审核通过。

1.2 免疫组织化学染色

将130例石蜡包埋的HCC组织脱蜡、水化、封闭后进行免疫组织化学染色。每例组织样本切片，分别单独加入抗ARID4B的兔单克隆抗体和抗DSN1兔多克隆抗体，4 ℃下孵育过夜。在显微镜下比较每例HCC组织和ANLT的染色情况，由两位病理学专家独立评估标本。

ARID4B位于细胞核和细胞质中，根据染色强度不同，缺色、弱，中、强分别记为0、1、2、3分。200倍显微镜下随机选取5个视野观察切片进行评估，取平均值作为该切片的染色强度评分。阳性细胞百分比<5%记为0分， 5%～50%(局灶性染色)记为1分，>50%(弥漫性染色)记为2分。然后将染色强度评分和阳性细胞评分的总和用于确定ARID4B的免疫反应性，≤1分为低表达，>1分为高表达。

DSN1染色也通过两个评分系统评估得分：阳性细胞评分和染色强度评分。染色强度评分标准：无染色、比背景略黄记为1分，黄褐色记为2分，棕色记为3分。200倍显微镜下随机选取5个视野观察切片进行评估，取平均值作为该切片的染色强度评分。阳性细胞评分标准：阳性细胞百分比0～5%记为0分， 6%～25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，>75%记为4分。

免疫组织化学染色总分=阳性细胞评分×染色强度评分。总分分为4个级别：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.3 蛋白免疫印迹检测

总蛋白提取使用RIPA缓冲液。采用BCA蛋白质定量试剂盒测定HCC组织和ANLT中的总蛋白水平。样本中蛋白通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并将其转移到聚偏二氟乙烯膜上，封闭后将样品与兔单克隆ARID4B、兔多克隆DSN1、兔多克隆GAPDH一级抗体在4 ℃孵育过夜。使用Millipore Immobilon Western化学发光HRP底物检测膜中的目标蛋白。

1.4 RNA提取和实时定量聚合酶链反应检测

RNAiso Plus(日本TaKaRa公司)用于从冷冻组织中提取总RNA，根据使用说明书进行试验，NanoDrop 2000仪器(美国Thermo Fisher Scientific公司)用于定量。使用PrimeScript RT Master Mix(日本TaKaRa公司)合成cDNA。通过SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(日本TaKaRa公司)和ABI 7900HT快速实时定量聚合酶链反应(real-time qPCR)系统(美国Thermo Fisher Scientific公司)，使用ARID4B和DSN1的基因特异性引物，采用real-time qPCR测定mRNA表达水平。real-time qPCR步骤：95 ℃持续30秒，然后是95 ℃ 5 s，进行60个循环,以及60 ℃ 30 s的40个循环。以GAPDH为内参，对数据进行归一化处理。mRNA相对表达水平以2-ΔΔCt计算。real-time qPCR测定均进行3次，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5 高通量数据处理

HCC的RNASeq数据从The Cancer Genome Atlas数据库(TCGA， http://gdc.cancer.gov/)下载，而基于Affymetrix平台的微阵列数据则从Gene Expression Omnibus数据库(GEO)GSE6764、GSE14520、 GSE36376、GSE45436、GSE62232下载(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。HCC中ARID4B、DNS1表达的数据是从基因表达谱交互式分析(GEPIA)在线数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)获得的。将TCGA中的数据进行log2转换，并使用Microsoft Excel 2016和GraphPad Prism 6软件对结果进行分析。

1.6 统计学分析

应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。采用t检验或Fisher精确检验比较两组之间的差异。采用χ2检验分析分类变量之间的关系。采用Cox回归和Kaplan-Meier分析评估各种预后因素对HCC患者总体生存和无病生存的影响。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC组织与ANLT中的ARID4B和DSN1表达水平比较

采用来自TCGA和GEO数据库的mRNA测序或微阵列数据集来分析ARID4B和DSN1的表达。这些数据表明，与ANLT相比，HCC组织中的ARID4B mRNA(图1A～E)和DSN1 mRNA(图2A～F)表达显著升高。

注：*P<0.05；****P<0.001图1 HCC组织与ANLT中的ARID4B mRNA及蛋白表达水平比较 A TCGA B GSE6764 C GSE14520 D GSE45436 E GSE62232 F ARID4B mRNA表达 G ARID4B蛋白免疫印迹 H ARID4B蛋白相对表达量

此外，分别采用real-time qPCR和蛋白免疫印迹法(Western Bolt)检测130对新鲜HCC组织和ANLT中的ARID4B和DSN1 mRNA及蛋白表达水平，发现HCC组织中的ARID4B(图1F～H)和DSN1(图2G)的表达高于ANLT。这些结果表明，与ANLT相比，ARID4B和DSN1 mRNA及蛋白在HCC组织中高表达。

注：*P<0.05；****P<0.001图2 HCC组织与ANLT中的DSN1 mRNA及蛋白表达水平比较 A TCGA B GSE6764 C GSE14520 D GSE36376 E GSE45436 F GSE62232 G DSN1 mRNA相对表达量

2.2 ARID4B和DSN1蛋白表达水平与临床病理特征的关系

为了探索ARID4B表达与HCC患者临床病理特征之间的关系，本研究对130例石蜡包埋的HCC组织进行了免疫组织化学染色。结果显示130例患者的HCC组织中，有74例(56.9%)ARID4B高表达，有81例(62.3%)DSN1高表达。 HCC组织中ARID4B和DSN1表达与患者临床病理特征之间的关系分析见表2。ARID4B高表达与肿瘤结节数量(P=0.042)和TNM分期(P=0.001)有显著相关性。DSN1高表达与性别(P= 0.035)、甲胎蛋白(AFP)(P=0.005)、肿瘤结节数量(P= 0.023)有显著相关性。

表2 HCC组织中ARID4B和DSN1表达与患者临床病理特征的关系(n=130)

2.3 ARID4B和DSN1表达水平与HCC患者不良生存率的关系

本研究对130例HCC患者的生存数据进行Kaplan-Meier分析，结果显示ARID4B、DSN1高表达的患者的总体生存率和无病生存率较ARID4B、DSN1低表达的患者低(图3)。多变量Cox比例风险分析显示，TNM分期(P=0.03)和ARID4B、DSN1表达水平(P=0.02，P<0.01)是总体生存的独立预后因素(表3)，并且TNM分期(P=0.04)和ARID4B、DSN1表达水平(P=0.03，P=0.02)也是无病生存的独立预后因素(表4)。上述数据表明，HCC组织中ARID4B、DSN1高表达可预示HCC患者的不良生存。

图3 ARID4B和DSN1表达与HCC患者的总体生存和无病生存曲线 A ARID4B表达与总体生存 B ARID4B表达与无病生存 C DSN1表达与总体生存 D DSN1表达与无病生存

表3 与总生存率相关的单因素和多因素Cox回归分析

表4 与无病生存率相关的单因素和多因素Cox回归分析

3 讨论

本研究探讨了HCC患者的ARID4B和DSN1表达与预后之间的关系。结果显示，与ANLT相比，HCC组织中的ARID4B和DSN1高表达，而HCC组织中ARID4B和DSN1表达较高的患者的预后较表达较低的患者差。此外，免疫组织化学染色分析提示，HCC组织中的ARID4B和DSN1蛋白表达水平与患者的临床病理特征和生存时间显著相关。这些结果提示ARID4B和DSN1在HCC组织中高表达，可作为预测HCC患者预后的指标。

TCGA和GEO是用于数千种肿瘤组织和肿瘤类型的高通量微阵列或下一代测序基因组数据集的公共存储库[13]。本研究分析了来自TCGA的RNA测序数据和来自GEO的微阵列数据，结果显示HCC组织中的ARID4B和DSN1表达水平较ANLT高。此外，采用real-time qPCR和Western Blot检测新鲜冻存的130对HCC组织与ANLT中的ARID4B、DSN1 mRNA和蛋白表达水平，获得与上述相似的结果。这些结果表明ARID4B和DSN1在HCC组织中的表达较ANLT高。

本研究采用免疫组织化学法检测了130例石蜡包埋的HCC样品中的ARID4B和DSN1表达水平。对ARID4B和DSN1表达水平与HCC患者临床病理特征之间关系的进行分析，结果显示ARID4B高表达与肿瘤结节数量、TNM分期有显著相关性，DSN1高表达与性别、AFP、肿瘤结节数量有显著相关性。有研究表明，肿瘤直径>5 cm、多发性肿瘤结节、AFP等临床病理特征与HCC的进展相关[14]。DSN1表达水平与患者的性别相关，原因可能是性激素可能会影响有丝分裂[15]。

Kaplan-Meier分析显示，ARID4B、DSN1高表达的患者的预后较ARID4B、DSN1低表达的患者差，Cox比例风险分析表明ARID4B、DSN1表达水平是总体生存和无病生存的独立预后因素。

既往研究显示ARID4B在正常睾丸中高表达[16]，且ARID4B与男性生殖系统肿瘤有关[17]。 另有研究表明ARID4B与酗酒有关[18]。此外，由于ARID4B参与细胞生长和分化[19]，因此该蛋白也与肿瘤密切相关。有研究报道ARID4B在乳腺癌的进展中起促进作用，而以miR-290为靶标的ARID4B调节则抑制了其促癌作用[8]。另一项研究发现，ARID4B等位基因的变异和差异表达可促进乳腺癌的进展[20]。ARID4B可用于分子成像检测胃癌，其可能可以作为治疗胃癌的靶标[21]。ARID4B还可以预测原发性脑肿瘤的肿瘤行为[9]。目前ARID4B对HCC的影响及其作用机制尚不清楚。关于ARID4B在HCC进展方面的机制是否涉及通过表观遗传调控的非编码RNA替代或其他特定机制，还需要进一步研究。根据本研究结果，ARID4B具有作为HCC生物学标志物的潜力。

DSN1是着丝粒体蛋白的组成部分，是人细胞中适当的着丝粒体组装所必需的[22]。着丝粒体组装对于细胞周期进程很重要[23]。在有丝分裂期间正确的染色体分离对于遗传物质的传播非常重要[24]。核纺锤体微管和动植物对于控制和确保正确的染色体分离至关重要。多项研究表明，染色体错位会导致遗传不稳定。而DSN1的耗竭会导致染色体错位及有丝分裂延迟。研究表明DSN1与细胞恶性增殖有关[12]。目前DSN1对HCC的影响及其作用机制尚不清楚，根据本研究的结果，DSN1具有作为HCC生物学标志物的潜力。

综上所述，ARID4B和DSN1高表达可预示HCC患者的预后不良，并且ARID4B和DSN1的表达水平是HCC患者总体生存和无病生存的独立预后因素。今后需进一步探讨ARID4B和DSN1促进HCC进展的分子机制。