沉默miR-30b-5p对非酒精性脂肪性肝病的干预效果及机制分析

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除乙醇因素外，以肝脏细胞脂质变性为特征的临床综合征[1]。随着人们生活水平的提高及不良饮食习惯盛行，NAFLD的发病率逐年升高，且有年轻化趋势[2]。NAFLD发病较为隐匿，疾病早期时肝功能无明显异常，但随疾病进展可发展为肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌等，严重影响患者的生活质量[3]。目前针对NAFLD的治疗方法主要包括增加运动量、控制饮食等，可在疾病早期改善患者症状，抑制病情进展，但对于上述方法难以改善的患者，必须接受药物治疗，然而目前尚未证实有何种药物对NAFLD是有益的[4]。有研究发现Toll样受体4(TLR4)在NAFLD中高表达，可促进NAFLD进展，抑制其表达可降低NAFLD损伤[5-6]。孙园园等[7]研究发现，miR-30b-5p可通过调节TLR4表达而调控葡萄膜炎的发展。本研究对miR-30b-5p可否通过调控TLR4而改善NAFLD损伤进行探讨，以期为NAFLD的防治提供帮助。

1 材料与方法

1.1 实验动物

研究选取46只雄性SPF级SD大鼠，均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2009-0004。在(23±2)℃和60%湿度环境下适应性饲养1周，明暗交替周期为12 h，期间给予水和普通饲料喂养。

1.2 试剂与仪器

普通饲料及高脂饲料购自北京奥博星生物技术有限公司，BCA蛋白定量测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，HE染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，兔多克隆抗TLR4抗体购自英国EterLife公司，1658001型垂直电泳槽和CFX Connect型PCR反应扩增仪由美国Bio-Rad公司生产，DYCP-31C型琼脂糖水平电泳仪由北京六一生物科技有限公司生产。引物序列由德国Qiagen公司设计合成，见表1。

表1 引物序列

1.3 方法

1.3.1 模型构建 随机选取36只大鼠，给予高脂饲料喂养，自由饮水、摄食，饲养12周。12周后，随机选取6只大鼠，处死并取其肝脏组织行HE染色，判断NAFLD造模是否成功。将剩余30只大鼠随机分为3组：模型组、空载体组、沉默组，每组10只。模型组大鼠不做任何处理，空载体组大鼠尾静脉注射腺病毒载体，沉默组大鼠尾静脉注射si-miR-30b-5p腺病毒载体。采用RT-qPCR法检测肝脏组织中miR-30b-5p水平，评价沉默miR-30b-5p成功与否。另外10只大鼠(正常组)给予普通饲料饲养，自由饮水、摄食，饲养16周[8-9]。

1.3.2 血脂及肝功能指标检测 各组大鼠饲养16周后，处死并取其肝脏组织称重，计算肝脏指数(肝脏指数=肝脏质量/体质量)。取部分肝脏组织于组织研磨机中研磨，将研磨液于3 500 r/min离心机中离心15 min，提取上层清液。用7020型全自动生化分析仪(日本日立公司)检测各组大鼠肝脏中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、三酰甘油(TG)及总胆固醇(TC)水平，试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3.3 HE染色观察肝脏组织病理学变化 取大鼠肝脏组织，用4%多聚甲醛固定，随后石蜡包埋、切片。切片后脱蜡、水化，然后采用HE染色观察肝脏组织病理学变化[10]。

1.3.4 RT-qPCR法检测肝脏组织中miR-30b-5p、TLR4 mRNA的表达水平 取肝脏组织，无菌环境中研磨，将研磨液于4 000 r/min离心机中离心15 min，提取上层清液。取上层清液置于总RNA提取试剂盒(美国Beyotime公司)中提取总RNA，并用722型紫外分光光度计(上海光学仪器五厂有限公司)检测其纯度。取2 μg总RNA于反转录试剂盒(美国Beyotime公司)中进行反转录反应。将反转录产物在PCR扩增仪中进行扩增，反应条件为94 ℃ 10 min预变性；95 ℃ 30 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，循环40 次。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量[11]。

1.3.5 Western blot法检测肝脏组织中TLR4蛋白的水平 取各组肝脏组织，加入RIPA裂解液提取总蛋白并进行定量，用10% SDS-PAGE分离胶电泳(120 V)至溴酚蓝跑出胶面，转膜缓冲液平衡(5 min/次，共3次)，转膜(300 mA 60 min)，用5%脱脂牛奶封闭1 h。PBS溶液洗膜(5 min/次，共3次)，滴加一抗(1∶1000)，4 ℃孵育过夜；PBST溶液洗膜(10 min/次，共3次)，滴加二抗(1∶5000)，室温下孵育1 h。PBST溶液洗膜(10 min/次，共3次)，用ELC发光液曝光显影，用ImageJ软件分析实验结果[12]。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组肝脏湿重和肝脏指数比较

各组肝脏湿重、肝脏指数比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比较，模型组、空载体组及沉默组的肝脏湿重、肝脏指数均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组和空载体组相比较，沉默组的肝脏湿重、肝脏指数均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组肝脏湿重、肝脏指数比较()

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与空载体组比较，cP<0.05

2.2 各组血脂及肝功能指标比较

各组TC、TG、ALT、AST水平比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与对照组相比较，模型组、空载体组及沉默组的TC、TG、ALT、AST表达水平均升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与模型组及空载体组相比较，miR-30b-5p沉默组的TC、TG、ALT、AST表达水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组血脂及肝功能指标比较()

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与空载体组比较，cP<0.05

2.3 各组肝脏组织HE染色结果

由图1可知，对照组肝小叶结构完整，肝索呈放射性分布，肝细胞内几乎无脂肪堆积；模型组和空载体组的肝细胞内有大量脂肪堆积，且门管区有炎性细胞，部分肝细胞坏死，多数已有纤维化病变；沉默组的肝细胞病变程度轻于模型组和空载体组，但仍可见肝小叶内部分汇管区有炎性反应，少数肝细胞坏死。

图1 各组肝脏组织的病理学变化 HE染色 ×400 A 对照组 B 模型组 C 空载体组 D 沉默组

2.4 各组肝脏组织miR-30b-5p和TLR4 mRNA的水平比较

各组肝脏组织miR-30b-5p、TLR4 mRNA水平比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与对照组相比较，模型组、空载体组及沉默组肝脏组织的miR-30b-5p、TLR4 mRNA水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组及空载体组相比较，沉默组肝脏组织的miR-30b-5p、TLR4 mRNA水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组肝脏组织miR-30b-5p、TLR4 mRNA的水平比较()

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与空载体组比较，cP<0.05

2.5 各组肝脏中TLR4蛋白水平比较

对照组、模型组、空载体组及沉默组肝脏中TLR4蛋白水平分别为0.55±0.10、1.49±0.15、1.51±0.11和0.85±0.14，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比较，模型组、空载体组及沉默组的TLR4蛋白水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组及空载体组相比较，沉默组的TLR4蛋白水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2各组肝脏TLR4蛋白水平比较A对照组B模型组C空载体组D沉默组

3 讨论

NAFLD的发病率逐年升高，不仅严重影响了人们的日常生活，也加大了社会负担。目前，关于NAFLD的发病机制尚未完全阐明，多认为其发病与遗传、氧化应激、胰岛素抵抗及肝脏脂代谢紊乱等有关[13]。本研究采用高脂饲料饲养SD大鼠，通过观察高脂饲料饲养的大鼠肝脏HE染色图像，发现肝细胞内大量脂肪堆积，且门管区有炎性细胞，部分肝细胞坏死，多数已有纤维化病变，表明NAFLD大鼠模型造模成功，可用于后续实验。目前NAFLD的治疗药物主要包括二甲双胍、阿托伐他汀及奥利司他等，但上述药物的疗效欠佳[14]。因此，亟待开发用于治疗NAFLD的新药物。随着基因工程技术的不断发展，针对疾病的靶向治疗药物的研究取得了突出成绩。本文探究了沉默miR-30b-5p对NAFLD大鼠的影响，以期阐明NAFLD的发病机制，为靶向药物的研制提供参考。

本研究通过尾静脉注射si-miR-30b-5p腺病毒载体抑制大鼠肝脏miR-30b-5p水平，发现沉默组大鼠肝脏miR-30b-5p水平低于模型组及空载体组，表明沉默miR-30b-5p成功，可用于本实验研究。通过比较发现，沉默组的肝脏湿重、肝脏指数、TC、TG、ALT及AST水平均低于模型组及空载体组，表明沉默miR-30b-5p可降低肝脏血脂水平，改善肝功能。有研究表明，TLR4/核因子κB(NF-κB)信号通路的活化可促进THP-1单核细胞分泌肿瘤坏死因子α及白细胞介素-1β，进而参与调节炎性反应[15]。目前有多项报道指出TLR4在NAFLD中高表达，抑制TLR4表达可改善NAFLD大鼠的肝脏脂质堆积、炎性反应及纤维化进展[5-6,16]。本研究结果显示，沉默组大鼠肝脏的TLR4 mRNA及TLR4蛋白水平均低于模型组及空载体组，提示沉默miR-30b-5p可抑制TLR4 mRNA及TLR4蛋白表达。

综上所述，沉默miR-30b-5p可抑制高脂饲料饲养所致的NAFLD损伤，从而保护肝脏，其机制可能与下调TLR4有关。本研究的结果为从基因水平上治疗NAFLD提供了参考。