Numb、NLRP3及IL-1β在溃疡性结肠炎静息状态及发病期的表达差异及临床意义研究

秦佳敏 陈小龙 敬朝强

溃疡性结肠炎(UC)是常见的炎症性肠病，是慢性肠道疾病的一种[1]，其发病机制尚未明确，近年来分子生物学研究认为，肠道蛋白酶的水解作用异常增强，患者的蛋白酶以及抗蛋白酶比例失衡，造成患者肠道蛋白水平异常，构成了疾病的病理基础。细胞命运决定子(Numb)通过促进肌球蛋白轻链的磷酸化，影响肠道黏膜屏障功能，从而改变肠黏膜通透性，促进患者肠道炎性反应[2]。炎性小体NLRP3的生理作用主要是对机体损伤信号的有效识别，通过调控一系列炎性因子的释放，最终导致患者细胞焦亡，且其表达水平与患者的肠道炎性反应程度存在一定的相关性。有报道指出，NLRP3的异常激活与肠道炎性疾病相关[3]。白细胞介素-1β(IL-1β)具有促炎性细胞分泌作用，通过增强结肠黏膜的炎性反应，激活局部T淋巴细胞和B淋巴细胞，上调患者的免疫功能，加重患者的临床症状[4]。本研究将通过观察Numb、NLRP3及IL-1β在UC静息状态以及发病期的表达差异及临床意义，为临床治疗和预后分析提供科学依据。

1 对象与方法

1.1 基本资料

选取2015年2月至2018年2月期间在四川绵阳四〇四医院就诊的100例处于发病期的UC患者作为研究对象(设为发病组)，另选取同期100例无临床症状的UC患者作为对照(设为静息组)。纳入标准：(1)符合UC的诊断标准[5]；(2)经结肠镜确诊；(3)签署知情同意书。排除标准：(1)心、肝、肾功能严重不全者；(2)存在交流障碍的患者；(3)不配合本研究方案者。发病组患者中男性62例，女性38例，年龄为31～54岁，平均年龄(36.57±5.04)岁，平均体质指数(BMI)为(24.06±3.76)kg/m2。根据《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012年·广州)》[5]，将发病组患者分为轻度39例、中度33例、重度28例。静息组患者中男性69例，女性31例，年龄为31～55岁，平均年龄(36.37±5.46)岁，平均BMI为(23.91±3.48)kg/m2。发病组及静息组患者的性别、年龄、BMI之间的差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 IL-1β检测 采集患者静脉血4 mL，3 500 r/min离心15 min，取上清液，采用放射免疫分析法检测患者的IL-1β水平，试剂盒购自北京市福瑞生物工程有限公司，操作方法严格按照说明书进行。

1.2.2 NLRP3蛋白检测 采集患者静脉血4 mL，3 500 r/min离心15 min，取患者的富血小板血浆再次离心，获得患者血小板，采用组织/细胞快速裂解液(RIPA)进行裂解后，继续离心取上清液，以1∶4比例加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白后，沸水浴10 min，洗去转膜液，加入Western封闭液2 h，分别以1∶200以及1∶500比例加入一抗及二抗，4 ℃孵育过夜。随后加入洗涤剂洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液，在室温条件下孵育2 h，再次加入洗涤液洗涤3次，最后采用发光试剂盒检测NLRP3蛋白，试剂盒购自上海罗氏制药有限公司，操作流程严格按照说明书进行。

1.2.3 Numb检测 所有患者均行结肠镜检查，获取患者的结肠黏膜组织，随后进行石蜡包埋，5 μm切片，采用兔抗人Numb多克隆抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗作为二抗，融化切片后，置于二甲苯以及乙醇中再次进行脱蜡，随后置入EDTA修复液中进行高压修复，修复完成后使用3%的过氧化氢进行内源性过氧化物酶去除，随后使用PBS溶液封闭1 h，立即加入一抗，4 ℃孵育过夜。再次使用PBS溶液进行洗涤，加入二抗，在室温条件下孵育1 h，之后进行DAB染色，苏木精染核，乙醇分色，脱水后，使用中性树脂进行封片，待检。使用光学显微镜观察上述标本，20倍放大后，随机选择4个视野，对染色阳性细胞进行计数。阳性细胞百分比≤5%记0分，6%～25%记1分，26%～75%记3分，>75%记4分。染色程度较弱记1分，中度染色记2分，强染色记3分。Numb的相对表达量为阳性细胞百分比与染色强度分数的乘积。

1.3 观察指标

比较发病组和静息组患者的Numb、NLRP3及IL-1β水平。比较发病组中不同疾病严重程度患者的Numb、NLRP3及IL-1β表达水平差异。分析不同疾病严重程度以及疾病状态与患者的Numb、NLRP3及IL-1β表达水平的相关性。采用多因素Logistic回归方法分析影响患者疾病严重程度以及疾病状态的相关因素。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 发病组和静息组患者的Numb、NLRP3及IL-1β表达水平比较

由表1可知，发病组患者的NLRP3及IL-1β表达水平显著高于静息组，而Numb表达水平低于静息组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 两组的Numb、NLRP3及IL-1β表达水平比较

2.2 不同疾病严重程度者的Numb、NLRP3及IL-1β表达水平比较

由表2可知，轻度、中度以及重度患者的Numb、NLRP3及IL-1β表达水平之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。通过两两比较发现，随着患者病情的加重，患者的Numb水平显著下降，NLRP3及IL-1β水平显著上升，差异均具有统计学意义(P均<0.05)。

表2 不同疾病严重程度患者的Numb、NLRP3及IL-1β表达水平比较

2.3 Numb、NLRP3及IL-1β表达水平与疾病严重程度的相关性分析

Pearson相关性分析显示，Numb与患者的疾病进展以及疾病状态呈负相关，NLRP3及IL-1β与患者的疾病进展以及疾病状态呈正相关，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见表3。

表3 Numb、NLRP3及IL-1β表达水平与疾病严重程度的相关性分析

2.4 患者的疾病严重程度以及疾病状态的多因素分析

将Numb、NLRP3及IL-1β表达水平纳入多因素Logistic回归模型，结果显示Numb、NLRP3及IL-1β表达水平均为UC患者疾病严重程度以及疾病状态的独立危险因素。详见表4。

表4 患者的疾病严重程度以及疾病状态的多因素分析

3 讨论

UC患者的发病机制尚未明确，目前认为肠黏膜上皮细胞损伤是其重要的病理生理学依据[6]。正常的肠黏膜组成了患者的肠道屏障，其肠黏膜上皮细胞、肠道菌群以及黏液处于相对稳定状态，在肠黏膜的表面附着有绒毛，而肠上皮细胞以及固有层在肠腔内突起，此时绒毛与固有层之间形成的隐窝称之为Lieberkühn隐窝[7]。在正常机体中，该隐窝中的干细胞通过新陈代谢以及细胞增殖的方式分化形成相应的杯状细胞、潘氏细胞以及内分泌细胞，作为在新陈代谢中凋亡细胞的补充，而Numb作为重要的干细胞命运决定子，对于患者肠黏膜细胞的分化起着决定性的作用[8]。此外，Numb是肠黏膜上皮细胞的特异性蛋白，在疾病的发生、发展过程中起着重要作用。NLRP3与UC的易感性相关[9]，主要在患者的血小板中表达，通过血小板的炎性反应参与了UC患者的病理生理过程。血液中活化的血小板可促进患者炎性因子以及血管生成因子释放，加重肠黏膜细胞及毛细血管的损伤程度，进而调控患者的免疫反应[10]。有研究证实，在激活患者的血小板后，可通过对患者的NLRP3、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)的激活[11]，介导患者血小板微粒中IL-1β释放入血，造成患者的IL-1β水平显著升高，通过上调机体的IL-1β以及NLRP3水平，促进疾病进展。

本研究通过对不同疾病严重程度以及不同疾病状态患者的分析显示，随着UC患者病情加重，患者的Numb水平显著下降，IL-1β以及NLRP3水平显著上升。相关性分析显示，患者的疾病严重程度以及疾病状态分别与患者的Numb水平呈负相关，与IL-1β以及NLRP3水平呈正相关，提示随着UC患者疾病严重程度加重，肠道正常菌群平衡被打破，局部炎性反应以及血管内皮细胞损伤情况加重，患者肠上皮细胞的自我更新程序遭到严重破坏，新陈代谢水平失衡，导致Numb水平显著下调，并且随着患者肠道炎性反应加剧，IL-1β以及NLRP3水平显著升高。张枭[12]的研究结果表明，患者的NLRP3水平与巨噬细胞的超活化水平具有一定的相关性。

综上所述，在UC疾病进展中，通过下调Numb水平，破坏了患者的肠道屏障功能，导致IL-1β以及NLRP3水平上调，发生肠道炎性反应，促进疾病进展，在今后的疾病预后分析以及早期诊断中可作为诊断依据。