RIPK1在克罗恩病组织中的表达及意义

卢 虹 李 辉 魏玉龙

克罗恩病(CD)是一种肠道非特异性炎症性肠病，具有病程长、易复发等特点[1-2]。CD患者临床表现为腹痛、腹泻等，或伴有发热[3]。目前CD的发病机制尚未完全阐明，多数学者认为其与遗传、感染、肠黏膜免疫缺陷及环境等因素有关[4]。受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)是RIP家族中的一员，主要负责调控细胞凋亡、坏死性凋亡和炎性反应[5]。有研究指出，RIPK1可通过抑制肠道上皮细胞凋亡和坏死，维持小鼠肠道稳态[6]。由此推测，人体肠上皮组织中的RIPK1可能参与了CD的发生及病情进展过程，但目前RIPK1在CD组织中的表达及其与患者预后关系的报道较少。本文对此开展研究，以期阐明RIPK1与CD患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年2月至2016年10月在巴彦淖尔市医院就诊的89例CD患者作为研究对象，CD的诊断标准参照《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012年·广州)》[7]。纳入标准：(1)患病年龄>18岁；(2)接受结直肠镜检查；(3)首次就诊并接受治疗。排除标准：(1)入组前服用抗炎药物；(2)合并急性感染性肠病；(3)合并严重的心、肝、肾等脏器功能障碍；(4)合并除CD以外的自身免疫性疾病。89例CD患者中，男性54例，女性35例，年龄为20～56岁，平均年龄为(37.20±4.21)岁。所有入组患者均对本研究知情，并签署知情同意书。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 临床资料收集

收集入组患者的年龄、性别、吸烟史、病变位置[回肠末端型(L1)、结肠型(L2)、回结肠型(L3)、上消化道型(L4，不合并L1～L3)]、上消化道受累情况、肛周病变、疾病行为[非狭窄非穿透型(B1)、狭窄型(B2)、穿透型(B3)，若合并腹腔内瘘管、炎性包块或脓肿则为B3型]及治疗方案等资料。

1.3 RIPK1蛋白水平检测

采用蛋白质免疫印迹法检测CD组织中的RIPK1蛋白水平[8]。滴加RIPA裂解液至盛有CD组织的试管中提取总蛋白，定量，滴加匀浆缓冲液，4 ℃环境中3 500 r/min离心10 min，取上清液。电泳100 min，缓冲液平衡，转膜，PBS洗膜。加入一抗，4 ℃孵育过夜；PBST漂洗，加入辣根过氧化物酶偶联的二抗，室温孵育1 h，PBST漂洗，曝光显影。应用ImageJ软件进行光密度分析。

1.4 治疗随访及预后评价

参照《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012年·广州)》[7]治疗CD患者。所有CD患者均给予纠正电解质平衡紊乱、营养支持、肠黏膜保护等措施，并根据患者的病情，针对性给予氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、免疫抑制剂或生物制剂等。

于CD患者出院1周后开始随访，了解其3年内的预后情况。将发生并发症(肠瘘、复杂肛瘘、肠穿孔、消化道大出血、腹腔脓肿、肠梗阻)、行肠切除手术及CD相关死亡视为预后不良[9]。若CD患者就诊后3个月内出现上述情况，则不纳入本研究进行分析。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 RIPK1评价CD患者预后的价值

89例CD患者中37例(41.57%)预后不良，其中并发肠瘘3例(3.37%)，复杂肛瘘4例(4.49%)，消化道大出血2例(2.25%)，腹腔脓肿3例(3.37%)，肠梗阻2例(2.25%)，行肠切除手术22例(24.72%)，死亡1例(1.12%)。预后不良组RIPK1蛋白表达水平为1.85±0.34，高于预后良好组(1.31±0.23)，差异有统计学意义(t=8.322，P<0.001)。RIPK1蛋白水平评价CD患者预后的ROC曲线下面积(AUC)为0.897(95%CI：0.826～0.968)，最大约登指数为0.718，其所对应的最佳截断点、敏感度和特异度分别为1.67、75.68%和96.15%。见图1。

图1 RIPK1蛋白水平评价CD患者预后的ROC曲线

2.2 两组患者基本资料比较

预后良好组与预后不良组在年龄、性别、吸烟史、病变位置、上消化道受累和首次治疗时使用糖皮质激素方面比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)；在疾病行为、肛周病变方面比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3 影响CD患者预后的相关因素分析

将可能影响CD患者预后的因素，包括上消化道受累、疾病行为、肛周病变和RIPK1蛋白水平作为自变量(纳入标准α≤0.1)，将CD患者预后作为因变量纳入多因素Logistic回归模型，结果显示疾病行为、肛周病变和RIPK1蛋白水平与CD患者的预后密切相关(P<0.05)。见表2。

表2 影响CD患者预后的相关因素分析

2.4 CD患者预后模型的构建

采用多因素Logistic回归方法构建由疾病行为、肛周病变和RIPK1蛋白水平三者联合诊断CD患者预后的模型(模型A)，F=-0.653+0.598×疾病行为+0.304×肛周病变+0.406×RIPK1蛋白水平。模型A评价CD患者预后的AUC为0.931(95%CI：0.878～0.984)，敏感度和特异度分别为100.00%和85.06%。见图2。

图2 模型A评价CD患者预后的ROC曲线

3 讨论

RIPK1在细胞凋亡、坏死性凋亡中起着关键作用[10]。已有多项研究指出，RIPK1可通过调节炎性反应、细胞凋亡、坏死性凋亡参与非酒精性脂肪性肝炎、结肠癌、肝细胞癌等的发生、发展过程，还可参与缺血再灌注损伤等[11-16]。肠道黏膜屏障由物理屏障、生物屏障、化学屏障及免疫屏障组成，主要包括肠黏膜上皮、肠黏液、肠道菌群、肠道淋巴组织和分泌型免疫球蛋白等。当机体任一屏障受损时，均可导致肠道稳态失衡，进而引发相应疾病。肠道细胞的生长、死亡和增殖三者间的平衡对于肠道稳态至关重要。有研究指出，RIPK1可通过调节核因子-κB抑制细胞死亡，也可通过调节Fas相关死亡结构域蛋白、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8参与细胞凋亡，还可通过调节RIPK3和混合谱系激酶结构域样蛋白参与细胞坏死过程[5,17]。由此推测，RIPK1蛋白可能通过上述机制调节肠黏膜炎性反应及细胞凋亡，从而参与CD的发生、发展。

本研究通过蛋白质免疫印迹法检测CD组织中RIPK1的蛋白水平，发现预后不良组患者的RIPK1蛋白水平高于预后良好组，提示RIPK1蛋白水平可能与CD患者的预后有关，检测其水平有望预测CD患者的预后情况。本研究进一步构建了RIPK1蛋白水平预测CD患者预后的ROC曲线，结果显示其AUC>0.8，具有一定的诊断效能，但敏感度较低。单因素及多因素Logistic回归分析结果显示，CD疾病行为、肛周病变和RIPK1蛋白水平与患者的预后密切相关。首次治疗时使用糖皮质激素已被国外学者认为是CD预后不良的预测因素[18]，与本研究结果存在差异，这可能与纳入样本的不同、例数不同等有关，今后需开展大样本、多中心研究进一步分析首次治疗时使用糖皮质激素是否与CD的预后不良有关。此外，本研究构建了由疾病行为、肛周病变和RIPK1蛋白水平组成的联合检测模型A，结果指出模型A评价CD患者预后的AUC、敏感度和特异度分别为0.931、100.00%和85.06%，提示其评价CD患者预后的效能较高，可较准确地判断CD患者的预后情况。

综上所述，CD组织中若RIPK1蛋白水平较高，则提示患者的预后不良风险较高。检测CD组织中的RIPK1蛋白水平有助于判断CD患者的预后情况，而联合疾病行为、肛周病变情况评价CD患者的预后，可弥补RIPK1蛋白水平单独评价的不足。