CD163+、CD204+巨噬细胞在胰腺癌组织中的浸润及临床意义

胰腺癌是消化系统中预后较差的恶性肿瘤之一，早期诊断困难，且具有较高的侵袭性和转移性，确诊后患者平均生存期<6个月，5年生存率<5%[1]。研究表明，肿瘤微环境包括多种细胞和分子，在肿瘤的发生、生长及转移等生物学行为中具有重要作用[2]。其中以肿瘤浸润性细胞、炎性细胞为代表的免疫反应是肿瘤微环境中的主要参与者之一。研究证实，在卵巢癌中，高比例的CD8+T细胞或CD45RO+记忆T细胞浸润肿瘤组织是有利于预后的指标[3]，相反如调节性T细胞(Treg)、骨髓源性抑制细胞(MDSC)和肿瘤相关巨噬细胞等，可通过抑制患者的免疫反应来加速肿瘤生长和转移[4]。巨噬细胞是主要的免疫群体之一，而免疫细胞在复杂的肿瘤微环境中扮演着十分重要的角色[5]。本研究采用免疫组织化学方法观察了CD163+、CD204+巨噬细胞在胰腺癌组织中的表达，并探讨其表达水平与临床病理及预后之间的关系。

1 资料与方法

1.1 基本资料

收集2016年6月至2018年10月间在四川大学华西医院被确诊为胰腺癌的52例患者的肿瘤组织标本和癌旁组织标本，所有患者术前均未进行放射治疗、化学治疗。52例患者中，男28例，女24例，平均年龄(61.32±10.31)岁；有淋巴结转移27例，无淋巴结转移25例；TNM分期为Ⅰ期10例，Ⅱ期17例，Ⅲ期19例，Ⅳ期6例。纳入标准：(1)术后经病理诊断证实为胰腺癌者；(2)在四川大学华西医院进行手术治疗者；(3)预计生存期≥1个月者(手术至患者失访或死亡的时间)；(4)临床资料及随访资料完整者；(5)未参与其他研究者。排除标准：(1)合并其他部位恶性肿瘤患者；(2)继发性肿瘤患者；(3)接受过放射治疗、化学治疗者；(4)合并精神疾病无法配合研究者；(5)不愿意参与本研究者。本研究经医院医学伦理委员会核准，所有入组患者均签署知情同意书。

1.2 组织标本取材及检测方法

所有患者的手术操作及标本采集均由同一组经验丰富的医师完成。胰腺癌组织标本取自典型病变部位，癌旁组织取自距胰腺癌病灶边缘5 cm处。组织标本经手术切除离体后，常规取材，采用10%中性福尔马林溶液固定，进行逐级脱水、透明，常规石蜡包埋，切片机连续切片，厚度为4 μm，然后应用免疫组织化学SP法染色，以检测组织标本中CD163+、CD204+巨噬细胞的表达水平。

1.3 判定标准及分组方法

阳性细胞染色标准：细胞结构清晰，着色与背景的对比清楚。应用100倍显微镜选取组织标本中3个阳性染色高密度区域，然后应用400倍显微镜对上述区域进行阳性细胞计数，取平均值。以区域内CD163+巨噬细胞≤18个为低表达组，CD163+巨噬细胞>19个为高表达组；以区域内CD204+巨噬细胞≤20个为低表达组，CD204+巨噬细胞>21个为高表达组。

1.4 观察指标

观察并分析CD163+、CD204+巨噬细胞表达与胰腺癌患者临床病理参数的关系，影响胰腺癌组织中CD163+、CD204+巨噬细胞表达的因素，以及不同CD163+、CD204+巨噬细胞表达水平患者的总生存率[随访终点为患者死亡或至本研究数据收集终点(2019年1月末)]。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 CD163+、CD204+巨噬细胞在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达

胰腺癌组织中CD163+、CD204+巨噬细胞计数分别为(18.54±2.64)个、(23.45±3.26)个，均高于癌旁组织的(13.18±1.54)个、(17.16±2.84)个，差异均有统计学意义(t=12.646,P<0.05；t=10.491，P<0.05)。

2.2 CD163+、CD204+巨噬细胞的表达水平与胰腺癌患者临床病理参数的单因素分析

单因素分析显示，在胰腺癌组织中，CD163+高表达患者与低表达者相比，在肿瘤大小、淋巴结转移、血管侵犯及TNM分期方面差异有统计学意义(P<0.05)；CD204+高表达患者与低表达者相比，在肿瘤大小、血管侵犯方面差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 CD163+、CD204+巨噬细胞的表达水平与胰腺癌患者临床病理参数的关系/例

2.3 影响胰腺癌组织中CD163+、CD204+巨噬细胞表达的Logistic回归分析

将单因素分析中显示差异有统计学意义的指标进行非条件Logistic回归分析，结果显示淋巴结转移是CD163+高表达的独立危险因素，有淋巴结转移患者出现CD163+高表达的概率约为无淋巴结转移患者的28倍(OR=28.596，P=0.001)；TNM分期是CD204+高表达的危险因素，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者出现CD204+高表达的概率约为Ⅰ～Ⅱ期患者的1.9倍(OR=1.926，P=0.029)；其余指标未见明显差异(P>0.05)。

2.4 CD163+、CD204+表达水平与胰腺癌患者预后的关系

在52例胰腺癌患者中，CD163+高表达者和低表达者均为26例，低表达患者的平均生存时间为(12.05±3.56)个月，高于高表达患者[(8.88±2.52)个月]，且差异有统计学意义(χ2=16.519，P<0.01)；CD204+高表达患者为25例，低表达患者为27例，低表达患者的平均生存时间为(9.43±3.11)个月，高于高表达患者[(6.01±2.26)个月]，且差异有统计学意义(χ2=21.278，P<0.01)。见图1。

图1 胰腺癌患者的Kaplan-meier生存曲线 A 不同CD163+表达水平的患者 B 不同CD204+表达水平的患者

3 讨论

胰腺癌具有高度侵袭性，缺乏早期诊断症状，发病率与病死率相近，总体预后极差[6]。肿瘤微环境包括肿瘤所在组织的结构、功能和代谢，与肿瘤细胞自身的(细胞核和细胞质)内在环境有关，且与肿瘤的生长关系密切[7]。肿瘤组织中浸润的炎性细胞大部分为巨噬细胞[8]。

巨噬细胞是机体固有免疫反应的重要组分，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是外周血单核细胞浸润至实体肿瘤组织中而演变成的巨噬细胞，依据其活化状态和功能可分为经典活化的巨噬细胞(M1型)和替代性活化的巨噬细胞(M2型)。活化的M1型TAM介导机体获得性免疫和肿瘤细胞的凋亡；而M2型TAM与M1型相反，其可发挥诱导炎性反应、肿瘤新生血管和淋巴管生成、免疫抑制等作用，促进肿瘤进展[9]。肿瘤细胞可分泌相关因子，诱导巨噬细胞向M2型转化，致使肿瘤组织中TAM以M2型为主[10-11]。研究发现，TAM在结直肠癌、肺癌及食管癌组织中高表达，且与患者的预后不良有关[12]。另有研究发现，M2型TAM高表达可促进胰腺癌患者淋巴血管生成和微转移，且其在肿瘤组织中浸润与低生存率明显相关[13]。CD163+、CD204+巨噬细胞均为M2型TAM的表型，本研究应用免疫组织化学方法观察了其在胰腺癌组织中的浸润，并分析其与临床病理参数的关系，以及不同CD163+、CD204+巨噬细胞表达水平患者之间预后的差异，以期为胰腺癌的分子靶向治疗及预后判断提供参考。结果发现，胰腺癌组织中的CD163+、CD204+巨噬细胞表达数目多于癌旁组织(P<0.05)，提示胰腺癌组织中存在M2型TAM浸润。此外，本研究结果还提示CD163+、CD204+巨噬细胞在胰腺癌的发生、进展中可能起着重要作用。有研究显示，CD163+在结直肠癌组织中浸润，且与分化程度、淋巴结转移等关系密切[14]。本研究进一步采用非条件Logistic回归分析显示，淋巴结转移是胰腺癌组织中CD163+巨噬细胞表达的危险因素，TNM分期是胰腺癌组织中CD204+巨噬细胞表达的危险因素。淋巴结转移与多种肿瘤的预后不良关系密切，TNM分期越高表示肿瘤发展越接近中晚期，而相应的CD163+、CD204+巨噬细胞表达阳性率越高，提示CD163+、CD204+可作为评估胰腺癌预后的候选指标，同时靶向耗损其在肿瘤组织中的浸润及其功能，将会是治疗胰腺癌的有效方法[14]。本研究进一步观察了不同CD163+、CD204+巨噬细胞表达水平患者总生存期之间的差异，发现CD163+、CD204+巨噬细胞高表达患者的总生存率均明显低于低表达患者(P<0.05)，提示两者高表达与患者的生存时间存在联系。有研究显示，M2型TAM高浸润与患者的低生存率明显相关[15]，这与本研究结果基本一致。

综上所述，胰腺癌患者肿瘤组织中存在CD163+、CD204+巨噬细胞浸润，且分别与患者的淋巴结转移、TNM分期关系密切，检测其表达水平对于评估胰腺癌的进展和预后具有一定参考价值。