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合成4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌构建及其催化体系优化

时间:2024-07-29

李英滋,张 宇,王道安,董解荣,王子申,张成林, ,陈 宁

(1. 天津科技大学生物工程学院,天津 300457;2. 菱花集团有限公司,济宁 272073)

4-羟基异亮氨酸为 L-异亮氨酸羟化物,具有血糖水平依赖的促进胰岛素分泌的特性以及促进脂肪代谢等功能,对糖尿病具有良好的治疗效果,具有广阔的应用前景[1-6].目前 4-羟基异亮氨酸的工业化生产主要采用胡芦巴种子提取法,然而此方法生产效率低(约 0.015%),致使生产规模小、产量低、成本高,严重限制了其应用[7-10].此外,化学合成法因在生产过程中使用产生乙醛等有毒或易爆物,且存在提取收率低等不足,仍停留在实验室研究阶段[9-12].Kodera等[9]在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)中发现了由 ido编码的异亮氨酸羟化酶(isoleucine dioxygenase,IDO),该酶能够以 L-异亮氨酸、α-酮戊二酸及氧气为底物催化生成 4-羟基异亮氨酸、琥珀酸和二氧化碳(图1[9]),为其生物合成提供重要基础.

图1 异亮氨酸羟化酶催化生成 4-羟异亮氨酸的反应示意图Fig. 1 IDO catalyzing 4-hydroxyisoleucine synthesis

Kivero等[12]将异亮氨酸羟化酶编码基因 ido转化至大肠杆菌,并在发酵过程中添加 L-异亮氨酸,实现前体物添加法合成 4-羟基异亮氨酸,优化条件下产量为 163.0mmol/L;但该方法存在 L-异亮氨酸被额外消耗及耗糖高等不足.Shi等[13-15]利用谷氨酸棒杆菌过表达ido,在优化条件下经144h发酵,最高产量达到95.7mmol/L;但该方法发酵周期长,产酸水平较低.本课题组在前期研究[16-17]中从苏云金芽胞杆菌B. thuringiensis TCCC 11826中克隆出ido(Accession No. KC884243),利用该基因建立了微生物转化法 4-羟基异亮氨酸合成体系,然而该方法产量较低(36h生成 44.6mmol/L).此外,在转化过程中底物L-异亮氨酸和α-酮戊二酸额外消耗严重,致使其转化率偏低(89.3%).本文针对上述问题,建立了静息细胞法合成 4-羟基异亮氨酸体系,并对催化条件进行优化,实现其高效合成.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

本文所用大肠杆菌Escherich coli BL21(DE3)以及质粒pXMJ-IDO和pET-28a均由本实验室保藏.

1.1.2 培养基

LB培养基(g/L):胰化蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10,pH 7.0~7.5,121℃高压蒸汽灭菌20min[18].

1.1.3 主要试剂

限制性内切酶、连接酶、DNA聚合酶等分子生物学试剂,宝生物工程(大连)有限公司;PCR产物回收、质粒提取等试剂盒,北京博大泰克生物基因技术有限责任公司;4-羟基异亮氨酸、L-异亮氨酸及α-酮戊二酸标准品,美国Sigma 公司.

1.2 方法

1.2.1 ido过表达菌株E. coli pET-ido的构建

以含ido基因的重组质粒pXMJ-IDO为模板,利用引物 ido-A:CCGCATATGATGAAAATGAGTGG CTTTAGCATAG(NdeⅠ)和 ido-B:CCGCTCGAGT TATTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGTTACTA(XhoⅠ),扩增 ido基因,经 NdeⅠ和 XhoⅠ酶切、回收后连接至经相同酶切的表达载体 pET-28a,然后转化至大肠杆菌 E. coli BL21(DE3)感受态细胞.转化子经菌落 PCR初步鉴定、活化后,提取重组质粒,分别利用 NdeⅠ以及 NdeⅠ和 XhoⅠ进行单、双酶切验证,并由苏州金唯智生物科技有限公司测定质粒中 ido序列.分别将重组质粒和重组菌株命名为pET-ido和E. coli pET-ido.

1.2.2 重组IDO诱导表达及静息细胞的培养和收集

将E. coli pET-ido于含100µg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中活化后,接种至 1L相同培养基,37℃、200r/min振荡培养至A600为0.6~0.8时,加入IPTG(终浓度为 0.1mmol/L),继续培养 4h,4℃、5000g离心 30min,收集菌体.取少量菌体超声破碎后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测[18].菌体经生理盐水清洗3次后,-80℃放置12h,即为静息细胞.待催化反应结束后,将反应液 5000g离心30min,回收菌体并用生理盐水清洗,称量后重复利用.

1.2.3 静息细胞法合成 4-羟基异亮氨酸的建立及条件优化

取静息细胞(终质量浓度为20g/L)置于3L反应体系中,37℃反应 16h.反应体系为:100mmol/L Tris-HCl(pH 7.0),200mmol/L L-异亮氨酸和α-酮戊二酸,5mmol/L FeSO4,10mmol/L 维生素 C(VC).进行反应条件优化时,根据需要改变相应条件.在单因素实验的基础上,进行正交实验L9(34)对催化条件进一步优化.

1.2.4 L-异亮氨酸、4-羟基异亮氨酸和α-酮戊二酸的检测

取反应液1mL,5000g离心1min后取上清液,经适当稀释后采用 2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色谱法测定 L-异亮氨酸和 4-羟基异亮氨酸浓度.检测条件:安捷伦 C18色谱柱(150mm×4.6mm,3.5µm),采用体积分数 50%乙腈/50mmol/L乙酸钠为流动相梯度洗脱,流量 1mL/min,检测波长360nm,柱温 33℃[16].α-酮戊二酸检测条件:伯乐Aminex HPX-87H色谱柱(300mm×7.8mm,9µm),流动相 5mmol/L H2SO4,流量 0.5mL/min,检测波长 215nm,柱温 30℃[19].按式(1)—式(3)计算 3种物质的浓度(mmol/L).

式中:S为利用高效液相色谱仪测定的 L-异亮氨酸、4-羟基异亮氨酸和α-酮戊二酸的峰面积.

1.2.5 4-羟基异亮氨酸产量和转化率

4-羟基异亮氨酸产量以反应体系中其浓度计,按式(4)计算转化率.

1.3 数据分析

每组实验均设置3个平行并重复3次,分别利用软件SPSS 13.0和Origin 8.0分析和处理实验数据.

2 结果与分析

2.1 E. coli pET-ido的构建

ido基因 PCR产物经酶切后连接至表达载体pET-28a,经转化、筛选获得转化子.挑取转化单菌落进行菌落PCR鉴定,结果如图2所示.

图2 E. coli pET-ido菌落 PCR和重组质粒 pET-ido酶切验证Fig. 2 PCR colony of E.coli pET-ido and pET-ido digested by restricted endonuclease

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,出现碱基数约为750bp的条带,与理论值(738bp,含限制性内切酶酶切序列和保护碱基)接近.提取重组质粒,进行酶切验证,质粒经单酶切获得碱基数约为6000bp的条带,与 pET-28a(5369bp)和 ido(732bp)的碱基数之和接近;质粒经双酶切获得碱基数分别为5000bp和750bp的条带,分别与 pET-28a和 ido碱基数接近,表明ido过表达重组质粒pET-ido和菌株E. coli pET-ido构建成功.对该质粒中ido基因测序发现,其碱基序列未发生突变.

2.2 重组IDO的表达

收集经IPTG诱导的E. coli pET-ido菌体细胞,破碎物经SDS-PAGE检测,结果如图3所示.E. coli pET-ido菌体破碎液、破碎物上清液和沉淀中均出现相对分子质量约为 2.90×104的条带,与其理论相对分子质量(2.892×104,包含 6个组氨酸标签)接近,而对照菌株则未出现相应条带.这表明重组 IDO能够于E. coli pET-ido成功可溶性表达.

图3 重组IDO的SDS-PAGEFig. 3 SDS-PAGE of recombinant IDO

2.3 静息细胞法合成4-羟基异亮氨酸体系的构建

在工业化生产中,利用纯酶进行催化合成 4-羟基异亮氨酸成本较高,采用微生物转化法或全细胞催化法是较为理想的方法[20-21].前期构建了大肠杆菌E. coli W3110转化法合成 4-羟基异亮氨酸,但其合成量低(36h产量为 44.6mmol/L)[16].其原因可能是细胞膜及细胞壁阻碍了 L-异亮氨酸和α-酮戊二酸输入以及4-羟基异亮氨酸输出.同时,还发现在转化过程中有部分 L-异亮氨酸和α-酮戊二酸额外消耗.静息细胞具有在反应过程中不生长、底物额外消耗量小以及底物和产物透过性强的特性[21].以 E. coli pET-ido静息细胞为酶源进行催化反应,结果如图 4(a)所示.随催化时间的延长,静息细胞催化4-羟基异亮氨酸生成量增加,12h达到最高值 185.6mmol/L,此时转化率为92.8%.而未经冷冻处理的活细胞仅能合成微量 4-羟基异亮氨酸(最高为 3.8mmol/L).由异亮氨酸羟化酶催化反应特性可知(图1),生成该浓度4-羟基异亮氨酸需要消耗同等量的 L-异亮氨酸和α-酮戊二酸.经检测,静息细胞对其实际消耗量分别为189.8mmol/L 和 189.5mmol/L(表 1),由此可见二者几乎无额外消耗.

图4 静息细胞合成 4-羟基异亮氨酸过程曲线及静息细胞使用次数对4-羟基异亮氨酸合成的影响Fig. 4 Production of 4-hydroxyisoleucine with resting cells and effect of recycle of resting cells on 4-hydroxyisoleucine production

静息细胞重复使用次数对 4-羟基异亮氨酸合成的影响如图 4(b)所示.静息细胞连续使用 5次后其催化 4-羟基异亮氨酸合成量未见显著降低,第 6次时略有降低,随后迅速降低.由此可见,利用静息细胞法可将L-异亮氨酸和α-酮戊二酸高效地转化为4-羟基异亮氨酸,且静息细胞可作为酶源被重复使用.

2.4 单因素优化静息细胞法合成4-羟基异亮氨酸条件

2.4.1 底物浓度对4-羟基异亮氨酸合成的影响

考察了不同浓度 L-异亮氨酸和α-酮戊二酸对4-羟基异亮氨酸合成的影响,结果如图 5所示,随二者浓度的增加,4-羟基异亮氨酸的合成量和转化率均逐渐提高,250mmol/L时,其合成量最高(分别为196.7mmol/L和 198.3mmol/L),但转化率(分别为78.7%和 79.3%)较底物浓度为 200mmol/L时低.为探究静息细胞法合成4-羟基异亮氨酸的潜在水平,选择L-异亮氨酸和α-酮戊二酸添加量为250mmol/L.

图5 L-异亮氨酸和α-酮戊二酸添加量对 4-羟基异亮氨酸合成的影响Fig. 5 Effect of L-isoleucine and α-ketoglutarate concentration on 4-hydroxyisoleucine production

2.4.2 静息细胞添加量对4-羟基异亮氨酸合成的影响

酶含量直接影响4-羟基异亮氨酸的合成效率,不同静息细胞添加量对其合成的影响如图6所示.

图6 静息细胞添加量对4-羟基异亮氨酸合成的影响Fig. 6 Effect of resting cells concentration on 4-hydroxyisoleucine production

由图 6可见:随着静息细胞添加量的增加,4-羟基异亮氨酸合成量提高,当添加量为 25g/L时产量和转化率最高,分别为208.5mmol/L和83.4%.

2.4.3 温度对4-羟基异亮氨酸合成的影响

温度可通过影响异亮氨酸羟化酶活性影响 4-羟基异亮氨酸合成效率.如图 7所示,4-羟基异亮氨酸生成量随着温度的升高而逐渐增加,35℃达到最高(208.6mmol/L),随后降低.前期研究结果表明,重组IDO 的最适反应温度为 35℃[16],这可能是该温度条件下4-羟基异亮氨酸生成量达到最高的原因.

图7 温度对4-羟基异亮氨酸合成的影响Fig. 7 Effect of temperature on 4-hydroxyisoleucine production

2.4.4 pH对4-羟基异亮氨酸合成的影响

pH亦可通过改变异亮氨酸羟化酶活性影响 4-羟基异亮氨酸合成效率.如图 8所示,随 pH升高,4-羟基异亮氨酸合成量增加,pH 9.0时最高(216.9mmol/L).然而,重组 IDO的最适反应 pH为7.0[16].检测发现,反应结束后该反应液的 pH 为6.8~7.5,故推测,其催化反应中由于 CO2的生成,致使反应体系pH降低.

图8 pH对4-羟基异亮氨酸合成的影响Fig. 8 Effect of pH on 4-hydroxyisoleucine production

2.4.5 金属离子对4-羟基异亮氨酸合成的影响

异亮氨酸羟化酶属于 Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶家族[10,22],因此Fe2+对其活性影响较大.考察了 Fe2+浓度对 4-羟基异亮氨酸合成的影响(图9).由图 9可知:不添加 Fe2+时,无 4-羟基异亮氨酸生成;随 Fe2+浓度提高,4-羟基异亮氨酸合成量先增加后减少,Fe2+浓度为10mmol/L时其浓度最高.

图9 Fe2+浓度对4-羟基异亮氨酸合成的影响Fig. 9 Effect of Fe2+ on 4-hydroxyisoleucine production

Ca2+对 4-羟基异亮氨酸合成具有明显抑制作用.然而,在一定浓度下 Na+、K+和 Mg2+对催化反应均具有促进作用,最高分别提高 3.76%、4.12%和5.69%.由于其促进作用并不明显,故在后续实验中不添加上述金属离子.

2.4.6 VC对4-羟基异亮氨酸合成的影响

Fe2+容易被氧化为 Fe3+,从而影响异亮氨酸羟化酶活性,VC作为抗氧化剂可有效防止Fe2+氧化[23-24].考察了 VC浓度对 4-羟基异亮氨酸合成的影响(图10).由图 10可知:不添加 VC时,4-羟基异亮氨酸生成量极低,其原因可能是Fe2+被氧化使得酶促反应难以进行;VC浓度为6mmol/L时,4-羟基异亮氨酸浓度最高.

图10 VC浓度对4-羟基异亮氨酸合成的影响Fig. 10 Effect of VC on 4-hydroxyisoleucine production

2.5 正交实验优化静息细胞法合成4-羟基异亮氨酸条件

由单因素实验可知,pH、静息细胞添加量以及Fe2+和VC浓度对4-羟基异亮氨酸的合成影响较大,因此利用正交实验对上述条件进行进一步优化,结果见表 2和表 3.上述 4因素均能显著影响 4-羟基异亮氨酸的合成(P<0.05),当 pH=9.0、静息细胞添加量为 27g/L、Fe2+和 VC 浓度分别为 8mmol/L和6mmol/L时,4-羟基异亮氨酸合成量达到最高值242.5mmol/L.

表2 正交实验结果Tab. 2 Rerulto of orthogonal experiment

表3 实验结果方差分析Tab. 3 Variance analysis of the results

2.6 最适条件下4-羟基异亮氨酸的合成及结果比较

利用上述最适条件(静息细胞添加量 27g/L,L-异亮氨酸 250mmol/L,α-酮戊二酸浓度250mmol/L,FeSO48mmol/L,VC 6mmol/L,反应温度 35℃,pH 9.0)进行验证实验.催化过程曲线如图11所示,随催化时间的增长,4-羟基异亮氨酸的产量以及 L-异亮氨酸和α-酮戊二酸的消耗量逐渐提高,12h时4-羟基异亮氨酸产量和转化率分别达到最高值249.6mmol/L和 99.8%,较优化前提高 34.5%和7.5%.该结果是目前已报道的生物法合成 4-羟基异亮氨酸的最高值,其主要指标比较见表4.

图11 优化条件下4-羟基异亮氨酸生成过程曲线Fig. 11 Curve of the production process of 4-hydroxyisoleucine under optimized condition

表4 已报道的生物法合成4-羟基异亮氨酸主要指标及与本研究对比Tab. 4 Comparision of this study with the reported data of biosynthesis of 4-hydroxyisoleucine

3 结 语

为提高 4-羟基异亮氨酸合成效率,建立了静息细胞法 4-羟基异亮氨酸合成体系,并避免了底物的额外消耗.在此基础上,对催化条件进行优化,获得最佳反应条件:静息细胞 27g/L,L-异亮氨酸250mmol/L,α-酮戊二酸 250mmol/L,FeSO48mmol/L,VC 6mmol/L,反应温度 35℃,pH 9.0.在此条件下,催化反应 12h,4-羟基异亮氨酸生成量和转化率均达到最高值,分别为 249.6mmol/L和99.8%,较优化前提高34.5%和7.5%.

在催化过程中,静息细胞内异亮氨酸羟化酶的平均催化速率为 0.67µmol/(min·mg),低于纯酶的催化速率 1.89µmol/(min·mg). 其原因可能是:(1)异亮氨酸羟化酶在 35℃条件下 4h后活性逐渐下降,10h后仅有 50%的活性.故推测,随催化时间延长,异亮氨酸羟化酶稳定性越低,剩余酶活性越少,其催化效率降低.(2)催化 4h后,4-羟基异亮氨酸浓度高于130mmol/L,可能对异亮氨酸羟化酶存在反馈抑制作用.后续研究可针对上述问题对异亮氨酸羟化酶进行改造,以期获得稳定性更高且解除反馈抑制作用的突变体,从而缩短催化周期.

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